miR-144-3p mimic 对泼尼松龙诱导的骨质疏松斑马鱼骨量的影响

王春庆 王佳瑶

骨质疏松（Osteoporosis，OP）是目前威胁人类健康的重大疾病之一。2000 年全世界60 岁以上男性和女性患者共有约3.5 亿，预计至2025 年全世界患病人数将增加到6.5 亿，发生骨折的风险率女性为30%～40%，男性为13%，且每年发生脆性骨折的患者达到千万例[1]。最新统计资料显示，2016 年我国60 周岁及以上人口达2.1 亿，占总人口的15.5%，65 周岁及以上人口1.3 亿，占总人口的10.1%。我国骨质疏松症患者近9 000 万，每年因此花费的医疗费用高达150 亿元[1]。目前，骨质疏松的发病机制还是未完全揭示，并且有效地治疗骨质疏松的手段和药物仍缺乏[2]。骨质疏松骨折发生后严重威胁老年人健康，致死率和致残率较高，但临床预防和治疗手段仍有待提高[3]。

骨代谢失调是骨质疏松的发病基础，骨代谢的调节机制复杂，受多种因素影响。近年研究发现MicroRNAs（miRNAs）是一类长约20～25 个核苷酸的非编码RNA，许多骨代谢相关基因受其调节，miRNAs 与靶基因的3'UTR 结合，影响mRNA 稳定性和抑制蛋白的翻译[4，5]，从而影响成骨细胞、破骨细胞增殖和分化，导致骨质疏松的发生。以往研究发现骨质疏松患者血清与骨组织中miR-144-3p表达下调，并通过细胞实验证实miR-144-3p 能够靶向调节RANK 从而抑制破骨细胞的增殖和分化[6]。miR-144-3p 参与破骨细胞代谢，但能否作为治疗靶点尚需验证。本实验以泼尼松龙诱导制作骨质疏松斑马鱼动物模型，以miR-144-3p 模拟物（miR-144-3p mimic）为干预措施，检测骨质疏松斑马鱼骨量及骨密度变化，观察miR-144-3p mimic对动物骨质疏松的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 Tuebingen 系野生型（WT）斑马鱼由贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心提供。

1.1.2 实验试剂 2×Taq Master Mix（货号：pr1701北京百泰克）；FastQuant RT Kit（With gDNase）试剂盒（货号：KR106 天根）；TRI reagent（货号：1382739 Invitrogen）；氯仿（货号：T130144 阿拉丁）；无水乙醇（货号：E111963 阿拉丁）；异丙醇（货号：A507048 上海生工）；泼尼松龙（货号：HY-17463 MedChemExpress）；茜素红（货号：130223 索莱宝）；miR-144-3p mimic（Forward：TACAGTATAGATGATGTAC，Revers：GTACATCATCTATACTGTA）和miR-144-3p mimic Negative Control（CTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTACA）均由广东锐博生物科技公司合成。

1.1.3 主要仪器 斑马鱼循环养殖系统（北京爱生科技发展有限公司）；显微注射仪（美国，HARVARD ASTP）；解剖显微镜（日本，SZX7，OLYMPUS）；体视显微镜（日本，SMZ645）；普通PCR 扩增仪（T100，Bio-RAD）；荧光定量PCR 仪（美国，Bio-RAD）；-20℃冰箱（中国，Haier）、光学粘性封膜 B（MSB1001，Bio-RAD）、低位裙边96 孔板（透明）、iTaq Universal SYBR Green Supermix（1725121，Bio-RAD）、Epp 管；载玻片、移液枪。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼胚胎获取 按雌雄1:2 比例选取斑马鱼成鱼，置于水温28.5℃的交配缸中分隔，每日光/暗时间控制在12h:12h，胚胎获取日拔除隔板，供雌雄交配。交配30min 后收取胚胎至胚胎营养液（Eggwater），此时胚胎大约为1～2 细胞期，按2～3 次/日更换Eggwater。胚胎置于28.5℃恒温箱中。

1.2.2 显微注射 加热拉制显微注射针头，在解剖显微镜视野中找到整齐排列的胚胎，调准焦距，寻找1～2 细胞期胚胎，使针尖对准胚胎胎膜，旋转推进旋钮，快速将针头从胚胎卵黄通过抵达细胞质中，注射体积为每胚胎1nL。

1.2.3 实时荧光定量PCR（q-PCR）测定 取斑马鱼胚胎置于Epp 管中，使用经典Trizol 法，收集沉淀RNA，冰上静置10min，待乙醇挥发完后加入50μL DEPC，电泳检查RNA 完整性。利用Thermo超微量分光光度计对总RNA 浓度和纯度进行测定。取斑马鱼总RNA 1μL，参考逆转录反应体系合成cDNA 第一链。取cDNA 样本稀释8 倍，加入miR-144-3p 茎环引物，配制反应混合液，设置一定的PCR 循环条件，将液体置于96 孔板上并将其放置在荧光定量PCR 仪中进行反应。记录CT值，用CT 值计算相对荧光定量（2-△△CT）。使用U6（Forward：TCGCTACGGTGGCACATA，Reverse：TATGGAGCGCTTCACGG）作为基因表达的内参，计算miR-144-3p 的相对表达量。

1.2.4 泼尼松龙液的配置 精密称取泼尼松龙白色粉末45.2mg，加入6.5mL DMSO 后混匀，加Eggwater定容至50mL，得2 500μmol/L 的泼尼松龙储备液。取1mL 泼尼松龙储备液加入99mL Eggwater，获得25μmol/L 的泼尼松龙液，配置后置4℃冰箱避光保存。

1.2.5 茜素红染液的制备 精密称取125mg 茜素红粉末，充分研磨，加入95%酒精25mL，充分混匀至肉眼无沉淀，即得橙红色0.5%茜素红溶液；称取KOH 白色晶体175mg，溶于25mL ddH2O，得0.7%KOH 溶液；0.5%茜素红溶液和0.7% KOH 溶液按照1:250 的比例混合，得蓝紫色茜素红染液，常温避光放置。

1.2.6 骨骼染色与分析方法 将斑马鱼幼鱼在4%多聚甲醛中浸泡固定，甲醛洗涤，并放置于-20℃冰箱内约2h 脱水。甲醇溶液中复水5min 后，加入配置好的茜素红染液常温染色2h，观察组织颜色。骨骼面积统计方法采用Image pro plus 6.0 专业图像分析软件计算，只统计被茜素红染色的钙化基质区域的面积和累积光密度值（IOD）。

1.3 实验步骤

1.3.1 确定miR-144-3p mimic 的最大检测剂量（MTD）实验分11 组：正常对照组，miR-144-3p mimic 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08pmoL/尾组，mimic negative control 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08pmoL/ 尾组。通过显微注射不同试验剂量，每组处理30 枚1～2 细胞期斑马鱼胚胎，每天 3 次（9:00、16:00、23:00），观察记录斑马鱼的生长发育及死亡情况，统计各组的斑马鱼死亡数量并在显微镜下观察斑马鱼心包水肿和每分钟心率情况。

1.3.2 骨质疏松模型建立 实验分5 组：空白对照组、mimic negative control 组（显微注射mimic negative control MTD）、mimic 组（显微注射miR-144-3p mimic MTD）、mimic+泼尼松龙组（显微注射miR-144-3p mimic MTD，并在Eggwater 培养4dpf 后将培养液更换为泼尼松龙液）、泼尼松龙组（Eggwater 培养 4dpf 后将培养液更换为泼尼松龙液）。mimic+泼尼松龙组和泼尼松龙组每天更换泼尼松龙液2 次（9:00，21:00），空白对照组、mimic negative control 组和mimic 组的Eggwater 以相同时间每天更换2 次。10dpf 时，用100mg/mL MS-222 麻醉剂处死各组斑马鱼幼鱼，并分别使用4%多聚甲醛固定，每组处理30 枚1～2 细胞期斑马鱼胚胎。

1.4 统计学方法每组数据的均值和标准差均使用Excel 软件计算，运用方差分析和Dunnett's T 检验进行统计学分析，P＜0.05 表明差异具有统计学意义，P＜0.001 表明差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 miR-144-3p mimic 最大耐受剂量（MTD）的测定在使用miR-144-3p mimic MTD 摸索实验中，发现0.08pmol/ 尾的miR-144-3p mimic 诱发13 尾斑马鱼出现心包水肿，发生率为43.3%，其心率为（39.186±19.524）次/min，较其他组明显减缓（P＜0.05）；而0.08pmoL/尾的mimic negative control诱发12 尾斑马鱼出现心包水肿，发生率为40.0%，其心率为（37.142±14.253）次/min，较其他组也明显减缓（P＜0.05）；正常对照组与其他各实验组斑马鱼的心包水肿发生率和心率变化情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结果表明，引起斑马鱼幼鱼毒性的半数致死浓度量为0.08pmol/尾，所以我们选用最适药物浓度及最大检测计量为半数致死量的一半，为0.04pmol/尾，mimic negative control组的剂量也为0.04pmol/尾。见表1。

表1 斑马鱼幼鱼心率和心包水肿情况（n=30）

2.2 胚胎显微注射miR-144-3p mimic 对斑马鱼体内miR-144-3p 表达量的影响通过基因相对表达量公式计算36、72hpf 的miR-144-3p 表达量，注射0.04pmol/尾miR-144-3p mimic 至斑马鱼胚胎中，miR-144-3p 的表达增多。36hpf 时，含量是正常对照组的12 倍，而72hpf 时则是正常对照组的8 倍。见图1。

图1 36、72hpf 时miR-144-3p 相对表达量

2.3 miR-144-3p mimic 对骨质疏松斑马鱼骨量、骨密度的影响挑选出放大400 倍（见图2）的斑马鱼骨染色图片并使用Image pro plus 6.0 软件计算每尾幼鱼图片中骨染色面积之和，即骨矿化量和骨密度。其中mimic 组的骨染色面积最高，泼尼松龙组的最低，mimic+泼尼松龙组较泼尼松龙组染色面积相对增高（P＜0.05）。不同组的染色面积与IOD 变化趋势一致，提示骨染色面积与骨密度呈现相同趋势（见图3、4）。

图2 各组斑马鱼骨染色图（×400）

图3 各组的骨矿化面积

图4 各组的IOD

3 讨论

目前关于miRNAs 的研究越来越多，大量研究证实miRNAs 能通过某些途径有效地影响骨代谢[7～10]。以往的研究显示miR-144-3p 参与多种肿瘤细胞增殖与分化[8，11]，证明miR-144-3p 是细胞代谢的重要调节分子，在细胞代谢过程中扮演重要角色[12，13]。

以往我们的研究证实，miR-24-3p、miR-27a-3p、miR-100，miR-125b 和miR-122a 5 个miRNAs 的表达相对于正常组，在骨质疏松组的血清和骨组织样品中的表达都是升高的，另外，miR-144-3p 相对于正常组，在骨质疏松组血清和骨组织样品中的表达都是降低的[14]。人体组织研究证实在骨质疏松发病过程中miRNAs 异常表达，但是否在发病中起重要作用，是否能作为治疗切入点还需进一步研究。

Fleming 等[15]对斑马鱼的生存环境进行加药处理，通过观察斑马鱼的骨骼发育情况，证明斑马鱼可以作为研究药物对骨骼发育情况的模式动物。本实验利用25μmol/L 的泼尼松龙液饲养斑马鱼，利用茜素红染色发现成功制作骨质疏松斑马鱼动物模型。试验周期短，成功率较高，是一种理想的研究骨质疏松的动物模型。

本实验通过毒理实验发现，大剂量的miR-144-3p mimic 会引起幼鱼出现心包水肿、心率减慢、心包畸形及死亡的现象，所以选取最合适的剂量是开展本实验的首要条件。最终，我们选择0.04pmol/尾为最合适的用药浓度。检测了实验组36hpf 和72hpf时的miR-144-3p 的相对表达量，结果发现这两个时间点的表达量较正常对照组增高，表明我们的干预是有效果并产生作用的，证明miR-144-3p mimic可以作为干预措施应用于生物体内。

茜素红与钙离子发生显色反应是茜素红染色的基本原理，是研究成骨分化的有效方法。显微注射miR-144-3p mimic 后骨质疏松斑马鱼茜素红染色显色反应加重，提示骨量增加，直接说明miR-144-3p mimic 对骨质疏松斑马鱼的治疗作用。

综上所述，miR-144-3p mimic 干预能显著增加骨质疏松斑马鱼骨量和骨密度，证实了miR-144-3p mimic 在动物体内对骨质疏松治疗有效，可作为治疗骨质疏松的药物进行进一步研究。