密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素在前列腺癌中的表达及相关性

孔慧梅 张春霆 郑志彬

1.金华职业技术学院医学院，浙江金华 321017；2.浙江省金华市人民医院泌尿外科，浙江金华 321000；3.浙江省金华市金磐开发区医院中医科，浙江金华 321000

前列腺癌（prostate cancer，PCa）已经成为威胁老年男性的常见疾病，目前我国PCa 发病率逐年增高，由于我国早期PCa 发现率低，临床中局部晚期和晚期的患者比例较高。PCa 细胞增殖、侵袭在临床中表现为前列腺癌患者的进展和转移[1]，PCa 的发生与遗传密切有关[2]。因此，基因在PCa 的发生进展中有重要作用。研究发现，密封蛋白-4 与卵巢癌、胰腺癌和肾癌发生进展有关[3-5]，也有对密封蛋白-4 与PCa 临床病理关系的部分研究显示，密封蛋白与PCa 分化程度和临床分期有关，但确切的机制并未清晰[6]。PCa 侵袭转移与细胞脱离原发肿瘤部位，侵入局部和远处转移有关[7-8]。研究发现，密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素都与细胞的黏附功能改变及新生血管形成有关[9]，血管上皮钙黏素是与细胞黏附密切相关的基因，其异常变化有助于肿瘤血管形成和转移[10]。TCGA 肿瘤数据库显示，密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素有相关性，但在PCa 的研究中鲜见报道。本研究采用免疫组织化学染色检测PCa 中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素的表达情况，对其与PCa 临床病理特征的关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取浙江省金华市人民医院泌尿外科2015 年1 月至2017 年12 月收治的82 例PCa 患者的癌及癌旁组织作为研究对象，患者年龄49～76 岁；Gleason 评分[7]≥7 分37 例，≤6 分45 例；国际抗癌联盟TNM 分期[11]：Ⅰ～Ⅱ期48 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例（来自PCa 穿刺标本，临床分期参考CT、MRI、ECT 综合检查结果进行分期）。纳入标准：①病理学确定PCa；②Ⅲ～Ⅳ期有CT、MRI、ECT 任何一个提示异常的客观证据。排除标准：①合并其他肿瘤；②化疗、放疗和内分泌治疗。本研究经金华职业技术学院医学院医学伦理委员会审核。

1.2 研究方法

免疫组织化学染色按照试剂盒说明书操作（北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：SP-0023-3 ml），研究标本组织石蜡包埋后，4 μm 石蜡标本连续切片、36℃烤片，脱蜡后抗原修复，0.3%H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物10 min，滴加一抗（1∶100），4℃冰箱过夜。兔抗人密封蛋白-4 蛋白多克隆抗体免疫组织化学染色（武汉博士德生物工程有限公司产品，工作浓度：1∶150，规格：50 μl，货号：YB-2597R），以PBS 代替一抗作阴性对照，次日滴加生物素标记的二抗（兔）及链霉菌抗生物素-过氧化物酶，室温孵育12 min。各步骤间均以0.1%PBS 洗5 min，共3 次，最后DAB 显色（北京中杉金桥生物技术公司产品，货号：D405772-1Set），常规脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。兔抗人血管上皮钙黏素多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品，工作浓度：1∶100，规格：50 μg，货号：abs13089），与上述实验步骤相同。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

染色结果由两位病理医师进行评估，判断标准参照国内文献[12]其表达情况评价阳性细胞比例。每张切片随机选取10 个视野（200×），计算每个视野中阳性细胞数占细胞总数的百分率，最后计算10 个视野阳性细胞百分率平均值。阳性细胞百分率＜5%为（-），5%～25%为（+），＞25%～50%为（++），＞50%为（+++），评价标准：（+）及以下为阴性，（++）及以上为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计数资料采用例数和百分率表示，比较采用χ2检验。采用Pearson 相关系数分析相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素在PCa 组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，密封蛋白-4 主要表达定位于细胞膜，呈褐色颗粒，血管上皮钙黏素主要表达定位于细胞膜/胞浆，棕褐色颗粒。见图1。

2.2 PCa 患者癌组织及癌旁组织中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素表达情况比较

PCa 患者癌组织密封蛋白-4、血管上皮钙黏素阳性表达率均高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 PCa 患者癌组织及癌旁正常组织中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素表达情况比较[例（%）]

2.3 不同特征PCa 患者癌组织中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素阳性表达比较

不同Gleason 评分、TNM 分期、术前前列腺特异性抗原及精囊浸润的密封蛋白-4 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同Gleason 评分、TNM 分期、术前前列腺特异性抗原、精囊浸润及切缘状况PCa 患者的血管上皮钙黏素的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同特征PCa 患者癌组织中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素阳性表达比较[例（%）]

2.4 在PCa 中的密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素表达的相关分析

相关性分析结果显示，PCa 中密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素表达呈正相关（r=0.794，P＜0.001）。

3 讨论

PCa 是危害男性健康的恶性肿瘤之一[13-14]，前列腺特异抗原作为PCa 普遍筛查指标广泛应用后，我国早期PCa 发现率明显提高，但部分地方未重视PCa筛查，早期发现率受到限制[15]。由于临床中出现进展的患者中有32%血清前列腺特异抗原检测结果正常，致使进展后局部症状加重和远处转移，患者生活质量下降[16]，因此，联合有效指标检测可提高PCa 的早期发现和进展预测。

PCa 表现复杂，单一基因并未能完全阐述发病机制[17]。研究发现，上皮间质转化在PCa 的发病中有重要作用[18-19]，上皮间质转化中血管钙黏素发挥重要作用，本课题组前期通过研究全人类基因表达谱，发现密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素在PCa 中存在异常增高，对TCGA 肿瘤数据库查询，发现密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素在PCa 中有相关性[20]。基于此，本研究对密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素在PCa 中的表达与PCa 的临床和病理关系进行分析，发现密封蛋白-4 在PCa 中增高表达，密封蛋白-4 增高表达与PCa 临床病理相关。不同Gleason 评分、TNM 分期、术前前列腺特异性抗原及精囊浸润PCa 患者癌组织的密封蛋白-4 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但密封蛋白-4 在PCa 中作用机制有待进一步探索。有研究对密封蛋白-4 通过脂氧素A4 对急性肺损伤肺泡上皮通透性的影响进行分析，发现脂氧素A4 影响密封蛋白-4 蛋白表达在肺泡上皮通透性中发挥作用[21]。对密封蛋白-4 与肿瘤预后相关性研究中，发现密封蛋白-4 高表达与胃癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺癌临床分期及预后相关[22-25]。

血管上皮钙黏素作为黏附分子家族的重要成员，在多种肿瘤的侵袭、转移中起重要作用[26]。本研究对血管上皮钙黏素在PCa 中的表达与PCa 临床病理相关性进行了研究，结果显示，不同Gleason 评分、TNM分期、术前前列腺特异抗原、精囊浸润及切缘状况PCa 患者癌组织的血管上皮钙黏素的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示血管上皮钙黏素表达增加了PCa 恶性增殖和异常分化。国内一项KLF17 基因对人结直肠癌血管上皮钙黏素表达及体外侵袭能力影响的研究采用靶向转染KLF17 表达质粒转染SW480 细胞及对照细胞，然后进行荧光定量PCR 和Western blot 检测转染前后KLF17 和血管上皮钙黏素基因蛋白表达水平。另外采用Transwell 实验检测转染KLF17 后SW480 细胞侵袭能力，结果发现转染后SW480 细胞KLF17 基因和蛋白表达水平均显著高于正常细胞，过表达KLF17 后SW480 细胞中血管上皮钙黏素水平下降，细胞侵袭能力降低，说明血管上皮钙黏素的表达降低可抑制肿瘤细胞的侵袭能力[27]。本研究结果也发现血管上皮钙黏素增高表达与PCa临床病理特征有关，相关性分析结果显示，密封蛋白-4 和血管上皮钙黏素表达呈正相关，提示在PCa 中两者存在相互促进作用。

综上，本研究发现PCa 不同病理特征与密封蛋白-4及血管上皮钙黏素有关，但其在PCa 发生进展中所扮演的角色复杂，为进一步了解其在PCa 中的作用机制，仍需在体内及体外实验的基础上进行深入研究。