稽留流产患者阴道菌群状况研究

石素雅 白会会 杜梦瑶 程冬梅 范琳媛 陈素文 刘朝晖

首都医科大学附属北京妇产医院 北京妇幼保健院妇科，北京 100026

自然流产是早期妊娠最为常见的并发症，其发生率占所有妊娠的15%～25%，而稽留流产是一种特殊类型的自然流产，是指胚胎或胎儿在已经死亡后滞留宫腔内而未能及时自然排出，占临床的15%～20%[1]。稽留流产导致弥散性血管内凝血的风险增加，或可发生多次成为复发性流产，严重影响孕妇身心健康。常见病因有胚胎染色体异常、解剖异常、内分泌异常、感染因素、自身免疫因素等。由阴道菌群失衡引起的感染可能会通过阴道上行传播到子宫，激活趋化因子并诱导局部免疫反应，进一步导致流产。另外，阴道菌群异常可能引起促炎性细胞因子升高，进而激活炎症途径，上行感染宫腔，降低子宫内膜容受性和着床，引起稽留流产[2-4]。本研究主要关注稽留流产患者阴道菌群情况及相关因素分析，以进一步揭示流产相关因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年9 月至2021 年6 月就诊于首都医科大学附属北京妇产医院的患者，将稽留流产患者30 例纳入试验组，正常早孕拟行人工流产患者30 例纳入对照组，并进一步将稽留流产患者根据胚胎绒毛染色体检查结果分为染色体正常组16 例、染色体异常组6 例、染色体不详组8例。所有入组者均知情同意，并通过首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会批准（2019-KY-075-01），填写调查问卷。稽留流产患者纳入标准：①年龄18～55 岁；②有性生活史，现妊娠时间＜12 周；③经临床检查及B 超辅助诊断确诊为胚胎停止发育。满足以上条件且胚胎绒毛染色体正常的胎停育患者纳入染色体正常组，满足以上条件且染色体数目或结构异常的胎停育患者纳入染色体异常组，满足以上条件但未行胚胎绒毛染色体检查的胎停育患者纳入染色体不详组。对照组纳入标准：①年龄18～55 岁；②有性生活史，现妊娠时间＜12周。排除标准：①72 h 内有性生活或阴道上药；②因其他疾病长期应用激素、抗菌药物或免疫抑制剂；③患有慢性全身系统性疾病或恶性肿瘤。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 ①基线资料，包括年龄、学历、月收入、吸烟、既往阴道炎史、既往泌尿系感染史、既往盆腔炎史、初次性生活年龄、既往流产史；②阴道微生态指标，包括形态学及功能学评价指标[5]，其中形态学上的评价指标包括菌群密集度、多样性、优势菌、乳杆菌分级、清洁度、细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）Nugent 评分、需氧菌性阴道炎（aerobic vaginitis，AV）Donders 评分、病原微生物检测（假丝酵母菌、BV）；功能学评价指标包括阴道分泌物酸碱度（pH 值）、过氧化氢、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、β 葡萄糖醛酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶。

1.2.2 样本收集 取两根无菌棉拭子采集阴道侧壁上1/3 的分泌物，其中一根拭子涂片，革兰染色处理后，油镜观察阴道菌群情况并评价上述微生态指标；另一根拭子置入含无菌生理盐水的2 ml EP 管内，-80℃密闭保存，用于菌群测定。

1.2.3 菌群测定及分析 本研究基于Illumina Novaseq测序平台，选取细菌16S rRNA 基因V3～V4高变区进行测序及微生物分类分析。具体步骤如下：提取阴道分泌物中的细菌DNA，PCR 扩增细菌16S rRNA 基因V3～V4区，构建基因文库，采用Illumina Novaseq 平台测序，首先使用Trimmomatic 对原始数据进行质量过滤，使用Cutadapt 进行引物序列的识别与去除，其后使用Flash 对双端序列进行拼接并去除嵌合体，最终得到高质量的有效序列用于后续分析。使用Usearch软件对有效序列按照97%相似度分成不同操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），选择丰度最高的序列作为OTU 代表序列，比对rRNA 基因数据库进行OTU 聚类分析、物种分类分析、Alpha 多样性分析、β 多样性分析、菌群差异分析，来进一步评价样本中的物种在不同分类水平上的相对丰度情况。其中Alpha 多样性反应单个样品物种的丰富度及均匀度，常用的度量菌群丰富度的指标有Ace 指数、Chao1 指数，其值越高，菌群丰富度越高；度量菌群多样性即菌群丰富度和均匀度的指标有香农-威纳多样性指数、辛普森多样性指数。香农-威纳多样性指数越高，辛普森多样性指数越低，代表菌群多样性越高。其中菌群差异分析主要是采用线性判别分析（line discriminant analysis effect size，LEfSe）来估算每个物种丰度对差异效果的影响，用于寻找各组间具有统计学差异的物种。

1.3 统计学方法

本研究采用SPSS 26.0 统计软件进行分析，定量资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验。计数资料以例数和百分率表示，比较采用χ2检验，等级计数资料比较采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组基线资料及微生态指标单因素比较

单因素组间基线资料比较结果显示，四组既往是否有盆腔炎史比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 四组患者基线资料比较

单因素组间微生态指标比较结果显示，四组菌群多样性、优势菌比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。菌群密集度、乳杆菌分级、清洁度、BV Nugent 评分、AV Donders 评分、假丝酵母菌、BV、pH 值、过氧化氢、白细胞酯酶、唾液酸苷酶比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；染色体正常组与对照组微生态指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；染色体异常组与对照组微生态指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 OTU 聚类分析

各组间OTU 有一定的重叠，应用R 软件绘制韦恩图以直观体现。本研究中稽留流产患者染色体正常组阴道分泌物获得1 463 个OTU，染色体异常组阴道分泌物获得1 237 个OTU，染色体不详组阴道分泌物获得1 323 个OTU，正常早孕组阴道分泌物获得1 597个OTU。正常早孕组OTU 数目更多，菌群更丰富。

2.3 物种分类分析

将OTU 根据数据库进行7 个水平的物种分类，即界、门、纲、目、科、属和种，本研究共注释出28 个门、67 个纲、167 个目、326 个科、641 个属、748个种水平物种，计算各物种丰度，并绘制统计图。见图1。

图1 60 份样本种分类水平中物种分布柱状图

2.3.1 在属分类水平上，对照组阴道菌群以乳杆菌属为主，稽留流产患者中染色体正常组占76.49%，染色体异常组占73.31%，染色体不详组占74.15%，而对照组占73.31%，次要优势菌属分别为加德纳菌属、普雷沃菌属、埃希氏-志贺菌属及嗜酸菌属，染色体正常组分别占4.21%、1.51%、0.99%、1.36%，染色体异常组分别占5.56%、0.90%、2.34%、1.32%，染色体不详组分别占2.82%、2.96%、1.57%、0.86%，而对照组分别占1.57%、1.68%、0.88%、1.41%。与对照组比较，稽留流产患者染色体正常组乳杆菌属增多，而染色体异常组及染色体不详组无明显变化；稽留流产各组加德纳菌属、埃希氏-志贺菌属均增多，嗜酸菌均减少；但染色体正常组及染色体异常组普雷沃菌属减少，而染色体不详组普雷沃菌属增多。见图2。

图2 四组阴道菌群属分类水平中物种分布柱状图

2.3.2 在种分类水平上，对照组阴道菌群以未分类乳杆菌为主，稽留流产患者中染色体正常组占42.35%，染色体异常组占64.33%，染色体不详组占41.91%，而对照组占47.41%，次要优势菌分别为惰性乳杆菌、阴道加德纳菌、埃希氏-志贺氏菌、嗜酸菌、巨型球菌、普雷沃菌，染色体正常组分别占34.11%、4.21%、0.99%、1.36%、0.79%、0.97%，染色体异常组分别占8.95%、5.56%、2.34%、1.32%、1.46%、0.04%，染色体不详组分别占32.26%、2.82%、1.57%、0.86%、0.37%、1.43%。与对照组比较，染色体正常组及染色体不详组未分类乳杆菌均减少，惰性乳杆菌均增多，而染色体异常组未分类乳杆菌增多，惰性乳杆菌减少；另外，稽留流产患者各组阴道加德纳菌、埃希氏-志贺氏菌均增多，嗜酸菌均减少，但染色体正常组与染色体不详组普雷沃菌增多，巨型球菌减少，而染色体异常组巨型球菌增多，普雷沃菌减少。见图3。

图3 四组阴道菌群种分类水平中物种分布柱状图

2.4 Alpha 多样性分析

结果显示，四组菌群丰度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中染色体正常组菌群丰度低于对照组（P＜0.05），但染色体异常组与对照组菌群丰度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），另外，四组间菌群多样性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 四组患者阴道分泌物菌群Alpha 多样性分析结果[M（P25，P75）]

2.5 β 多样性分析

研究基于Unweighted-unifrac 距离行PCoA 分析以比较四组间微生物的差异，结果显示第一主成分PCoA1 和第二主成分PCoA2 对区分各组的贡献度分别为18.74%和5.94%，四组阴道菌群比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。Anosim 分析对β 多样性差异进行了统计检验，提示β 多样性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 四组阴道菌群β 多样性分析

2.6 菌群差异分析

LEfSe 分析结果显示，四组阴道菌群无明显差异的物种。见图5。

图5 稽留流产各组与对照组阴道菌群的线性判别分析

3 讨论

女性阴道微生态系统主要是由阴道菌群、内分泌系统、阴道解剖结构及免疫系统共同组成的，各组之间相互协调[6]，其中，阴道菌群是阴道微生态系统的核心。育龄期女性阴道菌群主要是由种类繁多的需氧菌和厌氧菌组成的，其中乳杆菌是育龄期女性阴道菌群中的优势菌，寄生于女性阴道内的乳杆菌属多达20多种，最常见的4 种乳杆菌是卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和惰性乳杆菌，通过16S rRNA 测序的方法又将阴道菌群状态（community state type，CST）分为5 型：CST Ⅰ型（以卷曲乳杆菌为优势菌）、CST Ⅱ型（以加氏乳杆菌为优势菌）、CST Ⅲ型（以惰性乳杆菌为优势菌）、CST Ⅳ型（又称乳杆菌属缺失型，以厌氧菌等其他杂菌为优势菌）和CST Ⅴ型（以詹氏乳杆菌为优势菌），其中CST Ⅳ型又被分为ⅣA、ⅣB、ⅣC0、ⅣC1、ⅣC2、ⅣC3、ⅣC4 型，分别是以BVAB1、阴道加德纳菌、普雷沃菌、链球菌、肠球菌、双歧杆菌、葡萄球菌为优势菌[7]，乳杆菌尤其是卷曲乳杆菌，可以通过产乳酸、过氧化氢，分泌细菌毒素、黏附阴道上皮细胞等作用，抑制其他细菌生长，维持女性的生殖健康。

关于阴道菌群与胚胎发育之间的具体作用及机制目前研究尚少，目前认为，阴道菌群可能通过以下3 种机制影响妊娠：①阴道菌群可能是维持女性免疫系统平衡的因素，阴道菌群失调可能会引起免疫应答导致过度炎症反应[8]，表现为炎症介质及炎症因子（如白细胞介素-6、γ 干扰素、肿瘤坏死因子-α 等）的升高[9]，进而导致基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂-1 失衡[10]，损害胚胎的发育导致胎停育；②阴道菌群可能会在女性免疫功能减弱时上行感染子宫腔，形成子宫内膜的定植菌，可能影响胚胎种植，妨碍胚胎的发育[11]；③阴道菌群失调可能会引起宫颈阴道内的屏障功能减弱，增加宫颈细胞通透性，对胚胎发育造成影响。

妊娠期是育龄期女性的一段特殊时期，高雌激素水平可能会导致阴道上皮细胞糖原含量增加、阴道前庭腺体分泌增加、阴道及宫颈黏膜充血等生理变化，妊娠期阴道微生态受感染、遗传、种族、孕产史及应激等的影响[3]。现已有研究证明，妊娠期女性阴道微生态状态与非妊娠女性存在明显差异[12-14]，并且妊娠期阴道菌群的改变从早孕期即开始[15-16]。我国女性妊娠期阴道优势菌主要为卷曲乳杆菌[17]，德国一项研究同样证实了妊娠期女性阴道优势菌主要为卷曲乳杆菌，而只是部分女性妊娠期以惰性乳杆菌和阴道加德纳菌为优势菌，印度女性妊娠期阴道优势菌主要为加氏乳杆菌[18]。

本研究主要通过对染色体异常组、染色体正常组、对照组患者阴道菌群状况分析，来揭示稽留流产与阴道菌群之间的关系。本研究发现染色体异常组与对照组在物种组成、菌群丰度上无明显差异，但染色体正常组较对照组存在不同乳杆菌菌株比例失衡及除乳杆菌以外的其他细菌（如阴道加德纳菌、埃希氏-志贺菌、普雷沃菌等）相对丰度增加，故稽留流产患者存在的阴道菌群失调可能与稽留流产有关。目前认为，不同亚型乳杆菌可能对妊娠结局的影响不同[19-22]，以卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌为主的阴道菌群在妊娠中非常常见，与流产风险较低有关[23]，以惰性乳杆菌为主的阴道菌群似乎与特定妊娠相关病理发展的风险增加有关[24]，在稽留流产患者中卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌的相对丰度明显降低，而惰性乳杆菌增加，削弱了乳杆菌对生殖道正常生理功能的保护作用。另外，也有研究认为阴道菌群中乳杆菌相对丰度降低，可能会增加潜在病原体的丰度和多样性，这种乳杆菌水平低而细菌多样性增加的阴道菌群，已经检测到早产和流产的风险增加[11-12]；稽留流产患者除乳杆菌以外的其他菌群，如链球菌、普雷沃菌、阿托波菌[25]、解脲支原体、沙眼衣原体等相对丰度高于正常妊娠女性。其中，关于妊娠期支原体的筛查和治疗仍有争议，有一些研究证明稽留流产患者生殖支原体及解脲支原体相对丰度均降低[26]。还有研究报告称，支原体在阴道环境中普遍存在，似乎不会影响妊娠结局[27]，只有当症状出现时才需要治疗，所以还需要更多的证据来证实。

综上所述，妊娠期女性阴道微生态受多种因素的影响，在某些体内外因素的影响下，阴道菌群发生失衡，如乳杆菌相对丰度降低和/或乳杆菌菌株比例失调，或其他细菌（如加德纳菌、普雷沃菌、假单胞菌等）相对丰度增加，机体免疫力下降，上行感染宫腔，从而导致稽留流产，然而阴道菌群导致稽留流产的直接病因及机制目前尚未明确。随着科学技术的发展，可对阴道菌群进行宏基因组测序，寻找关键菌群及相关代谢通路，不断挖掘阴道微生态环境对妊娠结局的影响，进一步探索影响稽留流产的直接病因，从而指导临床应用。