基于核心InDel标记樱桃番茄种质资源的遗传多样性分析与应用

张 辉 李 鑫 王志敏 胡俊玲 鲁晓晓 潘峰 潘春阳 苏文悦 徐毛毛 张 敏 高浩冉 刘磊 黄泽军 王孝宣 杜永臣 李君明 朱文莹 国艳梅*

（1 青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266000；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育种全国重点实验室，北京 100081）

樱 桃 番 茄（Lycopersicon esculentumvar.cerasiformeA.Gray）是栽培种番茄的变种，果实风味独特、营养物质丰富。我国樱桃番茄产业起步较晚，20世纪80年代后随着人们生活水平的提高和消费观念的改变才发展起来，而日本早在1991—1996年报道的30 多个育成番茄品种中就有15 个是樱桃番茄，且形状及颜色丰富（唐树发和刘宝春，2004）。我国番茄育种资源缺乏，育种技术较为滞后（李君明 等，2021）。就樱桃番茄而言，近年来虽然育成了粉贝贝、圣桃T7、粉贝妮等系列新品种，但与国外、跨国公司推广的釜山88、夏日阳光等相比还存在一定差距，特别是近些年市场对樱桃番茄品种提出了色泽更鲜艳、形状更多样、风味品质更突出、综合抗性更强等系列新要求，也对樱桃番茄育种提出了新的挑战。种质资源遗传多样性是育种的基础，新种质的创制是育成优良新品种的重要保障。我国在“十三五”期间开展了番茄遗传资源精准鉴定，但数量和范围十分有限，特别对选育出的优良品系种质了解甚少。因此，有必要开展樱桃番茄优异种质遗传多样性分析，特别是要加强与国外优良新品种的比较分析，了解其异同，为优异种质创制及优良新品种选育提供必要的依据。

到目前为止，番茄已有数千份资源的重测序数据，挖掘了大量变异位点，为番茄遗传改良提供了有力技术保障。人们发现在番茄驯化和遗传改良过程中，基因组中存在的插入或缺失（InDel）片段分布广泛、密度大、数目多。利用InDel 标记分析基因组，不仅呈现共显性、稳定性好、多态性高和带型简单等优点，而且操作简单、方便、成本低（Jander et al.，2002；申璐 等，2011），已被广泛应用于玉米、水稻、绿豆、黄瓜和番茄等多种作物的纯度检测、资源遗传多样性分析、基因定位以及品种指纹图谱构建等（Choi et al.，2007；Mueller et al.，2009；Wang et al.，2010；兰青阔 等，2011；张体付 等，2012；Chen et al.，2013；李群三 等，2019；Manni et al.，2021），如Ngan 等（2016）利用6 个SSR 和35 个InDel 标记将62 个番茄品种（F1）划分为鲜食番茄、葡萄型、樱桃番茄3 个类群。同时，为了进一步规范市场，保护品种权，我国还先后出台了NY/T 2471—2013《番茄品种鉴定技术规程-InDel 分子标记法》和GB/T 28551—2020《植物品种鉴定-MNP 标记法》。虽然MNP标记法较InDel 对于实质性派生品种鉴定更为准确，但实施较为复杂，难以广泛普及，而InDel 标记法更为简便、灵活。

鉴于目前番茄品种鉴定的48 对核心InDel标记主要来自鲜食番茄和加工番茄（苏晓梅，2014），其在樱桃番茄种质资源中的多态性尚不十分清楚，同时缺乏对选育的大量樱桃番茄品种遗传多样性的深入了解。本试验利用48 对InDel 标记对多年来选育出的110 份樱桃番茄优异种质进行了遗传多样性分析，同时对市场收集的国内外优良品种进行了鉴定，旨在为樱桃番茄品种遗传改良及品种保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试樱桃番茄材料122 份，包括中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组多年来选育出的不同来源的樱桃番茄核心育种自交系110 份和市场上购买的商业种（F1）12 份，其中千禧、凤珠购自台湾农友种苗股份有限公司；圣桃T7、靓贝购自中农绿亨科技股份有限公司；粉贝贝购自南宁市桂福园农业有限公司；粉贝妮购自青岛奥锦生物科技有限公司；香妃12、香妃16 购自宁夏巨丰种苗有限责任公司；青春之歌购自河南豫艺种业科技发展有限公司；釜山88 购自韩国农友BIO 株式会社；粉喜购自华美种子有限责任公司；夏日阳光购自以色列海泽拉种子公司。2022年春季将122 份樱桃番茄材料统一编号，全部种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南圃场日光温室，每份材料种植10 株，进行常规田间管理，并对其主要性状进行调查，幼苗期取嫩叶提取DNA。

1.2 试验方法

分别在不同时期（开花期、坐果期、膨大期、红熟期）对生长类型、植株生长势、节间长度、叶色、叶量、果肩、果色、萼片、花序、果实形状、果实大小、耐裂性、可溶性固形物含量、风味等主要性状进行调查，具体参考《番茄种质资源描述规范和数据标准》（李锡香和杜永臣，2006）。2021年秋季对110 份自交系采用半轮配法并结合园艺性状和抗病基因配制了420 个F1组合，2022年春季种植在中国农业科学院寿光蔬菜研发中心番茄育种基地，单干整枝，根据植株生长势、抗病性、坐果率、风味等进行筛选鉴定。

待参试122 份材料第3 片真叶完全展开时，选取1 株长势正常的幼苗，取少量幼嫩叶片，分别装于2 mL 离心管中，采用改良CTAB 法提取基因组DNA（Bipinchandra et al.，2016）。PCR 反应体系为10 μL 体系：1 μL DNA 模板，0.25 μL 正向引物，0.25 μL 反向引物，5 μL 2 × PCR Master Mix，3.5 μL ddH2O。反应程序为95 ℃预变性3 min；95℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR 反应完成后，采用40%聚丙烯酰胺凝胶对PCR 产物进行凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶的成分包括40%聚丙烯酰胺溶液、10%过硫酸铵（APS）溶液、四甲基乙二胺溶液（TEMED）、10 × TBE 溶液和ddH2O。电泳结束后，采用0.1% AgNO3溶液对聚丙烯酰胺胶进行染色，然后用氢氧化钠与甲醛水溶液进行显色，照胶后统计电泳条带。

1.3 数据分析

根据公式PICi=1-∑Pij2计算标记多态性信息量PIC（polymorphism information content），式中i表示标记，Pij表示标记i的第j个等位基因出现的频率。根据基因分型结果，利用MEGA 7.0 软件计算遗传距离，利用MEGA 软件中的UPGMA 算法进行聚类分析（Kumar et al.，2016），并构建DNA指纹图谱。利用ADMIXTRUE 软件进行樱桃番茄群体结构分析，plink 软件进行樱桃番茄群体主成分分析。

1.4 DNA 指纹图谱构建

利用48 对InDel 标记构建了12 份樱桃番茄商业种和选出的综合性状优良组合的亲本的DNA指纹图谱。根据基因分型结果，将与参考基因组Heinz1706 基因型相同的记为1，与参考基因组不同的纯合基因型记为3，杂合基因型记为2，基因型缺失记为0。将每种材料的基因分型结果按照48对InDel 标记所在染色体和在染色体上物理位置的标记组合顺序排列，形成一串独特的编码，即可形成每种材料的DNA 指纹图谱。

48 对核心InDel 标记主要来自鲜食番茄和加工番茄（表1）（苏晓梅，2014）。

表1 番茄48 对核心InDel 标记信息

2 结果与分析

2.1 122 份樱桃番茄的主要性状特征

参试种质的14 个性状调查结果表明（表2），110 份优异樱桃番茄自交系大多数为无限生长类型，只有10 份为有限生长类型；从市场收集的12个商业种均为无限生长类型。122 份番茄材料中大多数植株生长势强，叶片深绿色，叶量偏多，节间长度中等，花序以单花序为主，萼片包括基平、上翘、直立、上卷等几种类型（王晶 等，2020），但未有包被类型；果色多数粉色，果形包括圆形、短椭圆形、椭圆形、卵圆形、梨形等，均耐裂，可溶性固形物含量为4.8%～10.0%。110 份自交系中，45 份风味较好；12 个商业种中6 个风味较好。综合植株生长势、果色、果形等表型可以看出，入选材料遗传多样性较为丰富。

表2 122 份樱桃番茄材料的主要性状特征

2.2 InDel 标记多态性分析

利用从鲜食番茄和加工番茄重测序中筛选出的48 对核心InDel 标记，对122 份樱桃番茄材料进行分析。结果表明，48 对InDel 标记在122 份樱桃番茄材料中均能扩增出清晰条带。48 对InDel 标记扩增的等位基因数在2～4 之间，各标记多态性信息量（PIC）在0.048 0～0.608 3 之间（表3），平均多态性信息量为0.472 3。

2.3 聚类分析

基于48 对核心InDel 标记，将122 份樱桃番茄材料分成3 个明显的类群（图1），其中第Ⅰ类群包括17 份材料，包含了粉喜、千禧、靓贝、圣桃T7、凤珠、香妃12、香妃16、青春之歌、夏日阳光9 个商业种，而自交系材料较少；第Ⅱ类群包括38 份材料，仅包括釜山88 1 个商业种；第Ⅲ类群包括67 份材料，包含粉贝贝、粉贝妮2 个商业种，大多数自交系位于第Ⅱ和第Ⅲ类群中。

图1 122 份樱桃番茄材料的聚类分析结果

2.4 群体结构与主成分分析

利用ADMIXTRUE 软件进行最佳K值估算，以确定122 份樱桃番茄材料的亚群数目。设置K值为1～20，CV_error 的值越小说明K值的结果越可靠，计算结果表明K为3 时，CV_error 的值最小（图2-a），122 份樱桃番茄材料分为3 个亚群。确定亚群数目后，对所有材料进行群体结构分析，结果发现所有材料均具有3 种遗传背景，部分材料发生了基因相互渗入（图2-b）。利用plink 软件对122 份樱桃番茄材料的遗传组成进行主成分分析（图2-c），结果表明12 个商业种中有11 个在48个位点多数呈现杂合，釜山88 几乎为纯合。

图2 122 份樱桃番茄材料的群体结构与主成分分析结果

2.5 遗传距离分析

利用48 对InDel 标记对122 份樱桃番茄材料进行遗传距离分析。结果表明122 份材料中，C357与C358，C354 与C395 的遗传距离为0，说明这些种质有可能相同或者极其类似；C436 与C458，C436 与C464，C352、C393、C403、C412、C425、C450、C446 与香妃16，C446 与靓贝的遗传距离最大，为0.886 cM；平均遗传距离为0.473 cM。仅从遗传距离来看，12 个商业种中粉喜与千禧遗传距离为0.029 cM，说明二者比较相似。

2.6 组合配制与分析

通过田间综合评价筛选，从420 个F1组合中筛选出综合性状优良的组合10 个，对这些组合的遗传距离进行了分析（表4），发现除组合C360 ×C374、C362 × C389、C362 × C391、C373 × C363外，其余组合的遗传距离接近或大于平均遗传距离0.473 cM。进一步分析C360 × C374、C362 ×C389、C362 × C391、C373 × C363 等4 个组合，发现这些组合入选的突出优点是风味好，产量较其他组合存在一定差异。

表4 10 个F1 组合的遗传距离

2.7 DNA 指纹图谱构建

由于试验所用48 对InDel 标记在12 个樱桃番茄商业种中都具有良好多态性，因此这48 对InDel标记可以将12 个樱桃番茄商业种完全区分开。同时对选出的综合性状优良组合的亲本进行DNA 指纹图谱构建，结果可以将这些材料完全区分开（表5）。利用这套标准可以对樱桃番茄种质进行品种鉴定和指纹图谱构建。

表5 基于48 个InDel 分子标记的12 个樱桃番茄商业种和16 份樱桃番茄自交系DNA 指纹图谱

3 结论与讨论

本试验对中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组多年积累选育出的110 份樱桃番茄核心育种材料和市场上收集到的12 个典型商业种，在初步表型评价的基础上，重点利用从栽培种鲜食番茄和加工番茄重测序中挖掘和筛选鉴定出的48 对核心InDel 标记进行遗传多样性分析。从生长类型、生长势、叶量、花序、果形、果色等表型性状来看，无论是选育出的110 份高代自交系还是12 个商业种，遗传多样性表现较为丰富；48对核心InDel 标记在122 份樱桃番茄材料中也呈现良好的多态性，与表型结果吻合。通过48 对核心InDel 标记进一步进行聚类分析和群体结构分析，均将122 份樱桃番茄材料划分为3 个明显的类群；而李艳红等（2021）依据表型将110 份樱桃番茄种质分为了5 个类群，史建磊等（2019）将21 份樱桃番茄种质分为4 个类群；通过重测序数据和驯化位点，Ranc 等（2008）将144 份樱桃番茄种质划分为两大类群。由于本试验表型非精准鉴定，故未用于聚类分析。本试验和Ranc 等（2008）的全基因组数据分析结果存在一定差异，有可能是分析角度不同所致。另外，本试验还发现第Ⅲ类群包含材料最多，这可能与国内樱桃番茄品种仍以粉贝贝、粉贝妮类型种植为主相关，大多数品种为粉贝贝、粉贝妮类型，所以收集分离材料与粉贝贝、粉贝妮类似；而第Ⅰ类群中包含多个商业种，涉及国内和国外的品种，国内育成的品种与千禧等较为密切，青春之歌与夏日阳光接近，只有少数育成的高代自交系与这些商业种遗传背景接近，说明在今后育种过程中应加强对这些商业种的研究，以便于拓宽现有遗传资源的背景。同时，对利用高代自交系配制的420 个组合进行综合评价，筛选出10 个优良新组合，其中4 个组合遗传距离明显低于平均遗传距离，这些组合的特点是风味较好；而其余6 个组合遗传距离均接近或者大于平均遗传距离，所以表现一定的杂种优势，特别是在产量方面表现明显的优势，说明遗传距离对于育种具有一定的参考价值。最后，利用48 对核心InDel 标记分析了入选10 个组合的亲本和12 个商业种，发现这些标记可以构建清晰的指纹图谱，可以很好地区分上述材料，对于将来品种身份鉴定及杂交种纯度鉴定具有较好的效果。