胃癌患者癌组织和血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达及其临床意义

王琦，曹嘉诚，张宇，蒋志阳，陶国青

南京医科大学附属无锡人民医院胃肠外科，江苏无锡 214023

胃癌是发生于胃部组织的一种消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿，早期无特异性症状，患者通常以恶心、呕吐等消化不良症状就诊，至晚期时预后较差［1-2］。目前临床上广泛使用的肿瘤标志物有血清癌胚抗原、糖类抗原199等，但这些指标对胃癌的诊断仍有较大局限性［3］。长链非编码核糖核酸（LncRNA）是一种长度超过200 nt 的非编码RNA，主要参与基因转录、转录后调控及表观遗传调控等过程，多种LncRNA 参与肿瘤发生发展过程［4］。研究显示，LncRNA 结肠癌相关转录因子1（CCAT1）在多种肿瘤中表达异常增高，且与肿瘤分期及患者预后具有相关性［5-6］。微小核糖核酸（miRNA）是一种16～25碱基长度的单链小分子RNA，miR-140-3p是miR-140的一种存在形式，属于miRNA 家族成员，被发现在卵巢癌、乳腺癌等恶性肿瘤中异常表达［7-8］。目前，关于LncRNA CCAT1、miR-140-3p 与胃癌的关系报道较少。2017 年1 月—2018 年1 月，本研究通过观察胃癌患者癌组织和血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达情况，分析两者的相关性，探讨其与患者临床病理特征、预后的关系及对胃癌的诊断价值，以期为胃癌的诊治提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经南京医科大学附属无锡人民医院医学伦理委员会批准（KY2016395），选取2017 年1 月—2018 年1 月于我院行胃癌根治术的胃癌患者为研究对象。纳入标准：①符合胃癌的临床诊断标准［9］且经术后病理组织检查确诊；②初诊且未接受任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整；④签署知情同意书。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②合并严重感染、免疫系统疾病；③心肝肾功能严重不全；④有精神性疾病或存在沟通障碍；⑤合并消化系统疾病。共选择符合上述标准的胃癌患者93 例为胃癌组，另选择我院同期就诊的胃部良性病变且排除恶性肿瘤、免疫系统疾病及心肝肾功能不全患者47例为良性病变组，同期在我院体检的健康对象47例为健康对照组。胃癌组男62例、女31例，年龄（59.64 ±9.76）岁；良性病变组男27例、女20例，年龄（57.43 ±10.38）岁，慢性胃炎25例、胃溃疡22例；健康对照组男29例、女18例。三组性别、年龄具有可比性。

1.2 胃癌及癌旁组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p检测 采用RT-qPCR 法。于胃癌根治术过程中留取患者肿瘤组织样本和癌旁组织样本，癌旁组织样本采集区域需距肿瘤组织边缘≥5 cm，将采集的样本立刻放于液氮中快速冷冻，保存在-80 ℃低温冰箱中。采用TRIzol 试剂盒（美国Invitrogen 公司）从胃癌组织和癌旁组织中提取总RNA，NanoDrop2000 光度计测定RNA 浓度和纯度。采用Takara Prime-Script 试剂盒（北京智杰方远科技有限公司）进行逆转录反应获取互补脱氧核糖核酸（cDNA），采用2720 型热循环PCR 系统（美国ABI 公司）及SYBR Green Mix 试剂盒（西安齐岳生物科技有限公司）对cDNA 进行扩增。反应体系：DNA 模板1 µL，上、下游引物各0.5 µL，SYBR Green qPCR Mix 10 µL，RNase-Free ddH2O 8 µL，共20 µL。引物序列：LncRNA CCAT1 上游引物5'-TGCTCACCTTACTGCCTGAGC-3'，下游引物5'-GGAGCGCACAACCTAGATCC-3'；miR-140-3p 上游引物5'-CGAGAGTGAGATGCACTG-3'，下游引物5'-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3'；GAPDH 上游引物5'-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3'，下游引物 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'；U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 扩增步骤：预变性95 ℃ 5 min，1个循环；变性95 ℃ 10 s，40 个循环；退火55 ℃ 30 s，40 个循环；延展72 ℃ 30 s，40 个循环。以GAPDH 为LncRNA CCAT1 的内参，以U6 为miR-140-3p 的内参，以2-ΔΔCt计算LncRNA CCAT1 及miR-140-3p 相对表达量，实验重复3次取平均值。

1.3 血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 检测 采用RT-qPCR 法。采集所有研究对象静脉血5 mL，胃癌组、良性病变组在未接受治疗前采集，健康对照组于体检当日采集。血标本在3 000 r/min下离心10 min，有效离心半径10 cm，收集血清装于含无核糖核酸酶的试管，保存于-80 ℃低温冰箱中。取血清样本25 ℃复融，4 ℃离心30 min，舍弃细胞碎片后再用注射过滤器过滤以尽可能去除细胞碎片，采用HiPure Exosome RNA Kit 外泌体提取试剂盒（美国Invitrogen 公司）提取血清外泌体沉淀，用PBS缓冲液重悬外泌体颗粒，取10 µL 悬液在铜网上吸附10 min，转移至3%的戊二醛溶液中悬浮5 min，冲洗2 min 后用乙酸双氧铀染色1 min，自然干燥后使用Talos F200i透射电子显微镜［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］观察外泌体的形态特征，另取10 µL悬液采用纳米颗粒跟踪分析系统（购自美国PSS 公司）检测外泌体粒径，使用Western blotting 法检测外泌体表面标记蛋白TSG101（TSG101 抗体购于赛默飞世尔科技公司）及CD54（CD54抗体购于赛默飞世尔科技公司）阳性表达情况。采用HiPure 外泌体RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司）从血清样本中提取外泌体总RNA，RT-qPCR 法检测血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 相对表达量，方法同“1.2”。

1.4 预后随访方法 胃癌患者出院以电话或门诊复查随访5 年，随访频率为前2 年每3 个月1 次，后3年每6 个月1 次，随访截止日期为2023 年1 月，随访终止事件为患者死亡或截止随访到期，记录患者生存时间并计算5年生存率。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料Shapiro-Wilk 进行正态性检验，符合正态分布的资料以-x±s表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析（F检验）；计数资料以n（%）表示，组间比较行χ2检验；采用Pearson 相关分析法分析患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1 与miR-140-3p 的相关性；以胃癌患者癌组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达的平均值为界限，将患者分为高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p 者，采用K-M 生存曲线比较高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p 患者5 年总生存率；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 对胃癌的诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌与癌旁组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达比较 胃癌、癌旁组织LncRNA CCAT1 相对表达量分别为2.67 ± 1.15、1.32 ± 0.61，miR-140-3p相对表达量分别为1.72 ± 0.83、3.83 ± 1.46；胃癌组织LncRNA CCAT1 表达高于癌旁组织，miR-140-3p表达低于癌旁组织（P均＜0.05）。

2.2 各组血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达比较 健康对照组、良性病变组及胃癌组血清外泌体LncRNA CCAT1 相对表达量分别为0.72 ±0.24、1.71 ± 0.43、2.25 ± 0.89，miR-140-3p 相对表达量分别为3.79 ± 1.07、2.65 ± 0.87、1.58 ± 0.77；血清外泌体LncRNA CCAT1 表达健康对照组＜良性病变组＜胃癌组，miR-140-3p 表达健康对照组＞良性病变组＞胃癌组（P均＜0.05）。

2.3 胃癌患者癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1 与miR-140-3p 表达的相关性 Pearson 相关分析显示，胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1表达与miR-140-3p表达均呈负相关（r分别为-0.726、-0.639，P均＜0.05）。

2.4 不同病理特征胃癌患者癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达比较 不同肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况的胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达比较差异具有统计学意义（P均＜0.05），不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达比较差异均无统计学意义。见表1、2。

表1 不同临床病理特征胃癌患者癌组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达比较（-x ± s）

2.5 癌组织及血清外泌体不同LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表达水平胃癌患者预后比较 93 例胃癌患者在随访过程中失访2 例，91 例完成随访的患者中共生存48例，患者5年总生存率为52.75%。91例胃癌患者中癌组织、血清外泌体LncRNA CCAT1高表达者分别为45 例、48 例，患者5 年总生存率分别为35.56%（16/45）、37.5%（18/48）；LncRNA CCAT1 低表达者分别为46 例、43 例，患者5 年总生存率分别为69.57%（32/46）、69.77%（30/43）；miR-140-3p 高表达者分别为39 例、40 例，患者5 年总生存率分别为76.92%（30/39）、67.5%（27/40）；miR-140-3p 低表达者分别为52 例、51 例，患者5 年总生存率分别为34.62%（18/52）、41.18%（21/51）。癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1高表达的胃癌患者5 年总生存率低于LncRNA CCAT1 低表达患者，miR-140-3p 高表达的胃癌患者5 年总生存率高于miR-140-3p低表达患者（P均＜0.01）。

2.6 血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 对胃癌的诊断价值 以胃癌组为阳性样本、良性病变组为阴性样本行ROC 分析，结果显示，血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 预测胃癌的曲线下面积分别为0.712、0.766，两者联合诊断胃癌的AUC 为0.845。见表3。

表3 血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p对胃癌的诊断价值

3 讨论

胃癌是一种发病率及病死率均较高的消化系统恶性肿瘤，其发生发展是多因素、多基因参与的复杂过程［10-11］。研究显示，不同临床分期的胃癌患者预后差异较大，总体而言，早期胃癌临床治疗效果好，而中晚期胃癌临床治疗效果较差［12］。多数胃癌患者早期多为无症状或仅表现为反酸、嗳气、上腹不适等非特异性症状，容易被忽视，确诊时多数患者已经进展为中晚期［13］。因此，及时诊断治疗对提高胃癌患者的临床疗效、改善预后具有重要意义。

LncRNA 是一种具有高度组织特异性的非编码RNA，参与乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生发展过程。LncRNA CCAT1是位于染色体8q24.21 上的一种LncRNA，在多种肿瘤中表达异常增高。本研究结果显示，胃癌患者癌组织LncRNA CCAT1 表达高于癌旁组织，血清外泌体中LncRNA CCAT1 表达胃癌组高于良性病变组，良性病变组高于健康对照组，且肿瘤分化程度低、浸润深度深、临床分期高及有淋巴结转移的胃癌患者癌组织、血清外泌体中LncRNA CCAT1 表达较高。这提示LncRNA CCAT1可能参与了胃癌的发生与病理进展过程，其机制可能为LncRNA CCAT1 表达上调通过调控癌基因蛋白激活了MAPK 信号通路，进而增强了胃肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移［14］。

miRNA 是广泛存在于真核生物的小分子非编码RNA，通过作用于靶信使RNA 参与细胞增殖、分化过程。miR-140 基因位于外显子16 和17 之间的E3泛素蛋白连接酶2基因上，miR-140-3p由miR-140前体转录而来，已被发现与多发性骨髓瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤等恶性肿瘤的发生发展有关［15］。本研究结果显示，胃癌患者癌组织miR-140-3p 表达低于癌旁组织，血清外泌体miR-140-3p 表达胃癌组低于良性病变组，良性病变组低于健康对照组，肿瘤分化程度低、浸润深度深、临床分期高及有淋巴结转移的胃癌患者癌组织和血清外泌体中miR-140-3p 表达较低。这提示miR-140-3p 可能作为抑癌基因参与了胃癌的发生发展过程，其机制可能为miR-140-3p一方面能够直接靶向抑制抗凋亡基因AKT2 的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移；另一方面，miR-140-3p 能够通过靶向环氧合酶2 诱导胃癌细胞凋亡，其表达降低导致胃癌细胞凋亡减少，更有利于肿瘤细胞的增殖［16］。

本研究结果显示，胃癌患者癌组织、血清外泌体LncRNA CCAT1 与miR-140-3p 表达呈负相关，提示LncRNA CCAT1可通过负向调控miR-140-3p参与胃癌的发生发展过程，其机制可能为LncRNA CCAT1抑制miR-140-3p 表达激活自噬相关基因5，从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭［17］。胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1 高表达者5 年总生存率低于LncRNA CCAT1 低表达患者，miR-140-3p 高表达者5 年总生存率高于miR-140-3p 低表达者，提示癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达与胃癌患者预后有关。其原因可能为LncRNA CCAT1 表达越高、miR-140-3p 表达越低，肿瘤分化程度越低，肿瘤浸润深度越深，淋巴结转移越严重，临床分期越高，导致患者预后越差。本研究进一步采用ROC 曲线分析血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p对胃癌的诊断价值，结果显示，血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 及两项联合诊断胃癌的AUC 分别为0.712、0.766、0.845，提示两项联合诊断胃癌的效能较高。

综上所述，胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1 表达上调，miR-140-3p 表达下调，其表达与患者肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况及预后有关，血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p 联合对胃癌具有较高的诊断价值。由于本研究为单中心研究且样本量相对较小，实验结果可能存在一定的偏倚，因此仍有待进一步多中心、大样本研究加以证实完善。