敲低S100A9对大鼠脑缺血再灌注损伤、炎症反应的影响及其机制

杨越，潘燕，丛丽娜，白杨

新疆医科大学附属第五医院神经内科，乌鲁木齐 830001

脑缺血再灌注损伤是由缺血脑组织的血液再灌注引起炎症因子大量释放所致，多发生于缺血性疾病的治疗阶段，可加重脑组织损伤，导致长期残疾甚至死亡［1］。S100是一组具有相似结构和功能的低分子量修饰结合蛋白，家族成员S100A9参与机体细胞凋亡、免疫炎症反应和胚胎发育，并可通过触发特定的信号通路，导致炎症因子如白细胞介素6（IL-6）、IL-1β 及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的上调［2-3］。有研究发现，S100A9 在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠脑组织中显著上调，触发TLR-4 或RAGE 介导的多种炎症通路，加剧脑缺血灌注再损伤［4］。作为炎症反应和免疫调节的主导信号途径，NF-κB 信号通路由介导多种细胞过程的重要转录因子组成，在典型的NF-κB 信号通路中，炎症细胞因子和趋化因子的多种刺激可激活p65、p50 及cRel 亚基［5］。MyD88作为一种保守的细胞内受体，在先天免疫系统中发挥重要作用，其可向toll样受体及IL-1受体下游传递信号，激活NF-κB信号通路，维持不同阶段的免疫强度和免疫稳态［6］。然而，缺血性脑卒中后S100A9 表达升高调控炎症反应的相关通路以及具体机制仍有待进一步研究。2022 年2 月—11 月，本研究通过敲低MCAO 模型大鼠脑组织中S100A9表达，观察其对大鼠神经功能、脑梗死体积、脑组织炎症细胞因子及NF-κB 信号通路相关蛋白的影响，以期为进一步明确脑缺血再灌注损伤的作用机制提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SPF 级SD 雄性大鼠30 只，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供；TTC 染料、SYBR green qPCR、Western blotting实验相关试剂及IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒（武汉默沙克）；p65、磷酸化p65（p-p65）、MyD88及GAPDH抗体（北京中山金桥）；PVDF膜（德国默克）；生理记录仪（美国BioPac）；脑立体定位仪（美国Stolelting）；实时荧光定量PCR（qPCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific）；Western blotting 实验相关的全套电泳仪、电泳槽、标准湿式转膜装置（美国Bio-Rad）；裂解缓冲液（美国Cell Signaling Technology）；细胞核和细胞质提取试剂盒（上海Beyotime Biotechnology）。

1.2 动物分组与MCAO 模型制备 大鼠随机分为假手术组（6 只）、模型组（6 只）、Lsh-NC 组（9 只）、Lsh-S100A9 组（9 只）。模型组、Lsh-NC 组、Lsh-S100A9 组采用线栓法制备MCAO 模型，大鼠在手术前禁食12 h之后，经腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠。将大鼠固定在仰卧位，通过颈正中切口暴露并分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。将一根2.5 号尼龙单丝通过颈总动脉插入颈内动脉内，阻塞右侧大脑动脉。随后移除尼龙单丝，闭塞2 h后再灌注24 h。假手术组不插栓，仅暴露颈总动脉及埋线处理。

1.3 大鼠脑组织慢病毒转染 在造模24 h 后将S100A9 敲低慢病毒及空载体分别注入Lsh-S100A9组、Lsh-NC 组大鼠脑内，注入速度为0.2 µL/min，总量为3 µL。定位坐标为前囟后3.6 mm，侧向2.0 mm，背向2.8 mm。每当针头定位后或是准备拔出前都停留1 min，注射结束后缝合伤口。

1.4 大鼠脑组织S100A9 mRNA 检测 采用RTqPCR 法。慢病毒转染30 min 后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取脑组织100 mg，TRIzol法提取组织总RNA，微量核酸测定仪检测总RNA 的纯度、浓度。按照M-MLV 试剂盒说明书操作将总RNA 进行逆转录合成cDNA，qPCR 实验进行扩增反应，具体参照qPCR 扩增试剂盒说明配制反应体系。引物序列：S100A9 上游引物5'-GCAGCATAAGCACCATCATCAAT-3'，下游引物5'-ACTTTCCCATCAGCATCATACACTC-3'；GAPDH 上游引物5'-GCCTTCCGTGTTCCTACCCC-3'，下 游 引 物 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。以GAPDH 为内参，按2-ΔΔCt计算S100A9 mRNA相对表达量。

1.5 神经功能缺损程度评价 采用NSS 评分标准对大鼠神经功能缺损程度进行评价。0 分：神经功能正常；1 分：轻度神经功能缺损（提尾时左前肢屈曲）；2 分：中度神经功能缺损（行走时向左侧转圈）；3分：中度神经功能缺损（向左侧倾斜）；4分：无自发行走，意识减退；5分：死亡。

1.6 大鼠脑组织梗死体积测算 采用TTC 染色。各组麻醉后打开其胸腔，用4%多聚甲醛从心尖部灌注。接下来，将灌注后的大脑在4%多聚甲醛中固定2 d，浸入30%的蔗糖溶液中。用切片机切出30 µm的切片，-20 ℃冰箱保存。在黑暗中于37 ℃下用1% TTC染色15～20 min。将TTC染色的大脑在室温下用4%甲醛固定24 h，并用数码相机拍照。使用Image J 软件分析梗塞体积，遵循双盲原则。计算公式：梗死体积百分比=100%×（左侧半球正常脑容积-右侧半球正常脑容积）/左侧半球正常脑容积。

1.7 大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α 检测 采用ELISA 法。由缺血处脑组织获得实验样本后进行全蛋白提取，收集培养物上清液，保存在-80 ℃冰箱直至使用。ELISA 法检测各组大鼠脑组织内IL-1β、IL-6、TNF-α 用于评估炎症水平，各项操作严格按照ELISA试剂盒的说明进行。

1.8 大鼠脑组织p65、p-p65 及MyD88 蛋白检测采用Western blotting 法。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液裂解和提取Lsh-NC 组及Lsh-S100A9 组缺血侧脑组织的蛋白质，使用细胞核和细胞质提取试剂盒提取细胞核和细胞质蛋白。蛋白质通过10%～12% SDS-PAGE 分离并转移至PVDF 膜，在室温下用TBST 中的5%脱脂奶粉封闭1.5 h 后，将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。在次日用TBST洗膜，滴加对应二抗，室温1 h。使用Image J软件分析条带灰度值，以GAPDH 作为内源性对照，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism7 统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk 法行正态性检验，呈正态分布的数据以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组S100A9 mRNA 表达比较 假手术组、模型组、Lsh-NC 组、Lsh-S100A9 组S100A9 mRNA 表达分别为0.84 ± 0.22、1.56 ± 0.35、1.47 ± 0.48、0.33 ±0.23；S100A9 表达模型组、Lsh-NC 组＞假手术组＞Lsh-S100A9组（P均＜0.05）。

2.2 各组神经功能缺损程度评分比较 假手术组、模型组、Lsh-NC 组、Lsh-S100A9 组神经功能缺损程度评分分别为（0.00 ± 0.00）、（4.00 ± 0.82）、（4.33 ±0.47）、（1.33 ± 0.47）分；神经功能缺损程度评分模型组、Lsh-NC 组＞Lsh-S100A9 组＞假手术组（P均＜0.05）。

2.3 各组脑梗死体积比较 模型组、假手术组、Lsh-NC 组、Lsh-S100A9 组缺血侧脑梗死体积分别为48.95% ± 2.82%、0.00% ± 0.00%、48.41% ±6.96%、26.94% ± 3.92%；缺血侧脑梗死体积模型组、Lsh-NC 组＞Lsh-S100A9 组＞假手术组（P均＜0.05）。

2.4 各组脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α 表达比较 脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α 表达模型组、Lsh-NC 组＞Lsh-S100A9组＞假手术组（P均＜0.01）。见表1。

表1 各组脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达比较（）

表1 各组脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

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2.5 Lsh-NC 组、Lsh-S100A9 组脑组织p65、p-p65 及MyD88 蛋白表达比较 Lsh-S100A9 组脑组织pp65、MyD88 蛋白表达低于Lsh-NC 组（P均＜0.01），两组脑组织p65表达差异无统计学意义。见表2。

表2 各组脑组织p65、p-p65及MyD88蛋白表达比较（-x ± s）

3 讨论

脑卒中是导致中老年人死亡和残疾的主要原因之一，具有起病急、发展迅速、预后差的特点。对于高致残率和高病死率的脑卒中疾病，常以恢复血液供应为主要治疗手段，然而，恢复血液供应过程中不可避免地会引起脑缺血再灌注损伤［7］。因此，寻找新的治疗方法、有效的生物标志物以及新的干预靶点非常有必要。本研究结果显示，S100A9 mRNA 在MCAO 模型脑组织中上调，可通过增加脑梗死体积和损伤神经功能来促进大脑发生缺血再灌注损伤，这与之前研究一致［2，8］。本研究同时发现，抑制S100A9 的表达可以有效降低脑缺血再灌注损伤引起的炎症，减少脑梗死体积，降低神经功能缺损评分，提示S100A9能够通过升高炎症因子的表达发挥促炎作用。S100A9 作为一种低分子量修饰结合蛋白，可介导许多炎症反应的调控，具有促炎作用，与之前报道一致［9-10］。

越来越多的证据表明，炎症反应会导致脑缺血再灌注后发生继发性脑损伤［11］。来自大脑皮层的免疫效应细胞会产生并释放大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α 和IL-6等。这些促炎因子会启动并加重炎症反应，进一步加重脑损伤［12］。因此，减少促炎因子的产生和释放是减轻缺血再灌注损伤的有效治疗手段［13］。有研究表明，在缺血性脑损伤期间上调TNF-α、IL-1β 皆可加重脑损伤，而在使用相应的中和抗体后，损伤程度明显降低［3，14］。研究显示，S100A9能够诱导MyD88 受体复合物从细胞质转移到细胞膜，并与活性受体相互作用，从而激活NF-κB信号通路，刺激炎症因子产生［15］。近期研究发现，S100A9可通过诱导RAGE 受体的表达并与其结合，激活NF-κB 信号通路，介导炎症因子的产生，在免疫、炎症反应中起到关键作用［16］。p65 及MyD88 作为NF-κB 通路的关键因子能够很好地反映S100A9 对NF-κB 通路的调控作用。p65 在细胞内定位于细胞质中，并与IκB蛋白结合在一起，形成非激活状态的NF-κB复合物，当NF-κB 通路被激活时，p-p65 的表达升高［5-6］；而信号分子MyD88 通过触发IκB 的降解，促使NF-κB 复合物进入细胞核并激活特定的基因，从而调控免疫和炎症反应。

本研究通过构建大鼠MCAO 模型发现，造模引起大鼠脑梗死体积增多，大鼠神经功能缺损程度升高；而与Lsh-NC 组比较，S100A9 慢病毒干预可显著降低MCAO大鼠脑梗死体积和大鼠神经功能缺损评分。采用ELISA 法检测炎症因子水平可见，与假手术组比较，MCAO模型大鼠脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表达升高，而Lsh-S100A9 组中炎症因子表达降低。qPCR 结果显示，相较于假手术组，S100A9 表达在模型组中上调，S100A9 敲低慢病毒干预后脑组织中S100A9表达降低。上述结果提示，在脑缺血再灌注损伤发生后，S100A9 表达升高，敲低S100A9表达可以抑制炎症因子表达，改善大鼠脑缺血再灌注损伤。我们进一步采用Western blotting法检测Lsh-NC 组和Lsh-S100A9 组大鼠脑组织中p-p65、p65 及MyD88 的蛋白表达，发现与LSh-NC 组比较，LSh-S100A9 组大鼠脑组织中p-p65、MyD88 蛋白表达下调，提示S100A9可能通过上调促炎细胞因子促进脑缺血再灌注损伤并可能通过调控NF-κB信号通路影响炎症。

综上所述，S100A9 在MCAO 模型大鼠脑组织中表达升高，敲低S100A9 可减轻脑组织炎症、神经功能缺损程度及梗死体积，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，其机制可能与调控NF-κB 信号通路影响炎症反应有关。S100A9 或可成为脑缺血再灌注损的潜在治疗靶点发挥作用。但是，本研究只进行了敲低S100A9 对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织影响的体外实验，存在一定的局限性，未对S100A9 如何通过NF-κB信号通路影响炎症反应的具体生物学行为做更深入的探讨，这些问题我们将在后续实验中更进一步进行研究。