四川炉霍县牦牛源蜱种类的形态学及分子生物学鉴定

洛绒邓珠，蓝 岚，向 阳，潘 瑶，郝力力

（1.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；3.四川省盐亭县高端人才服务中心，四川 盐亭 621600）

1 材料与方法

1.1 样本采集 2021年3月～2021年8月，分别在炉霍县雅德乡、斯木乡、仁达乡、旦都乡、泥巴乡和宜木乡6个乡的416头牦牛体表采集蜱。在各乡选3～4个村，各村选2～4个农场，从每头牦牛的体表采集5～6 只蜱。按照地点编号分别装入采集管中，塞入潮湿脱脂棉，经形态学鉴定后将蜱浸于75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要试剂及仪器 试剂：组织基因组DNA提 取 试 剂 盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、Trans 2K DNA Marker、1×TAE 溶液和琼脂糖购自北京全式金公司，1.1×T3 Super PCR Mix购自北京擎科生物有限公司；引物合成与测序均由生工生物工程（成都）有限公司完成。仪器：德国徕卡体式显微镜（Leica S9D），多功能生物样品均质器（Bertin Precelly 24），赛默飞微量离心机（Pico 17），德国耶拿Biometra TRIO 三槽PCR 仪（Biometra TRIO 48），北京六一仪器厂电泳仪（DYY-6C），全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon 5200 Multi）。

1.3 蜱形态学鉴定 根据《中国畜禽寄生虫形态分类图谱》［1］，在体视显微镜下观察蜱形态特征并拍照保存。

1.4 DNA提取 取出保存在75%乙醇溶液中的蜱，用无菌去离子水冲洗3 次。待干燥后沿蜱纵向中轴线切为两半，分别装入两支1.5 mL EP 管中，一支置于－80 ℃冰箱冻存，一支加入500 μL无菌水用多功能生物样品均质器充分研磨。研磨程序如下：每管加入陶瓷珠（直径0.5 mm 的20 珠和2 mm 的5 珠），5 500 g 研磨2 次，4 000 g 研磨1 次。取 研 磨 液200 μL，根 据EasyPure Genomic DNA Kit 试剂盒说明书提取蜱基因组DNA，－20 ℃保存备用。

1.5 PCR 检测 参照Abdullah 等［2］报道的方法对蜱进行分子鉴定，引物信息见表1。PCR 扩增体系如下：模板1 μL，上游、下游引物各1 μL（10 μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，充分混匀。设阳性对照和阴性对照（去离子水）。蜱ITS2基因的扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，共40 个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。

表1 PCR引物

1.6 序列分析及统计分析 将全部阳性样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，使用DNAStar 软件对所得全部序列进行拼接分析，在NCBI网站中使用BLAST比对，再使用MEGA 6.0软件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值为1 000）构建分子进化树，并用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析（P＜0.05 表示差异具有统计学意义）。

2 结果

2.1 样本采集数量及形态学鉴定 经初步鉴定，在炉霍县的6 个采集点共鉴定出2 种蜱，即微小扇头蜱与青海血蜱。其中，微小扇头蜱791只，占96.5%，为优势种；青海血蜱29只，占3.5%。在仁达乡、斯木乡、宜木乡、泥巴乡这4 个采集点只采集到微小扇头蜱；在旦都乡和雅德乡则采集到这两种蜱。结果详见表2。

2.2 蜱的分子鉴定

2.2.1 蜱ITS2 基因扩增 以1.4 中提取的DNA为模板，采用常规PCR方法扩增蜱的ITS2基因片段，结果显示在1 600 bp左右处出现条带，与预期片段大小相符（图1）。

图1 蜱ITS2基因的PCR扩增结果（部分样本）

2.2.2ITS2 基因遗传进化分析 将测序所得的全部序列进行拼接、比对后共得到19条不同的序列，其中5 条为青海血蜱（H.qinghaiensisLuhuo 1-4），其余14 条为微小扇头蜱（R.microplusLuhuo 1-14）。选取经BLAST比对后同源性最高的1～2条序列确定种，显示为青海血蜱及微小扇头蜱；在NCBI 中选取分离自不同地区的青海血蜱和微小扇头蜱的ITS2基因序列，选取其他几个种的血蜱和革蜱的ITS2基因序列作为参考序列，构建分子进化树（如图2和图3所示）。本研究所得的5 条青海血蜱序列均与甘肃平凉（JQ737119）、青海省（JQ737115）H.qinghaiensis的亲缘关系最近，并聚于一大支，相似性在97.4%～97.6%。

图2 ITS2基因构建青海血蜱进化树

图3 ITS2基因构建微小扇头蜱进化树

R.microplusLuhuo1-14 的相似性在97.6%以上，其差异在0.1%～2.3%。进化分析显示14 条序列均与微小扇头蜱的亲缘关系最近，聚于一支，相似性在99.2%～100%。其中，R.microplusLuhuo2 与贵州（JQ737125）分离到的微小扇头蜱的亲缘性最高，为100%；R.microplusLuhuo12 与湖南湘西（MK224585）分离到的微小扇头蜱的同源性最低，为99.2%。

3 讨论

形态学鉴定要求鉴定人员的专业能力较强、工作经验丰富，如蜱存在肢体不完整或外形极为相似的情况，则较难鉴定［3-4］。在寄生虫的分子鉴定方法中，当前最为常用的是RCR 和DNA 测序。自2003 年Hebert 等提出DNA 分类学可用于物种鉴定以来，DNA 条形码技术得到了迅速发展，目前已被广泛应用于寄生虫的鉴定［5-6］。

本研究仅鉴定出2 种蜱，即微小扇头蜱和青海血蜱，这可能与本次收集蜱的方法、宿主及收集蜱的地理位置有关。本研究中微小扇头蜱的占比高达96.5%，为炉霍县半农牧地区的优势蜱种，可能是体表采集这种方式及微小扇头蜱本身的生活史导致的，因为它是典型的一宿主蜱，幼虫、若虫、成虫各阶段均在一个宿主上生长发育，只有饱血后的成虫才会离开宿主，并且它的主要生活环境也是以农区为主。6个采样点均属于半农牧地区，地理位置均分布在鲜水河沿线两岸，故农牧民的放牧区域主要集中于沿河流域的草地、农区等，此类地区均为蜱类适宜生存的地区。本研究中青海血蜱的占比较少，仅为3.5%，仅在雅德乡、旦都乡有检出，这可能和采集方法、宿主有关系，因其为三宿主蜱，在幼虫阶段、若虫阶段、成虫阶段吸饱血后都会脱落，其生活史中九成时间都属于非寄生阶段。非寄生阶段的蜱栖息于草原、森林等环境中。

本研究样本仅在牦牛的体表采集，今后可以采用其他方法如布旗法，或者扩展被采集样本的宿主种类，如犏牛、藏绵羊等，以进一步了解炉霍县分布的蜱种类。另外，不同种类的蜱赖以生存的环境条件有所差异，如海拔高度、季节时间、植被类型等。炉霍县境内平均海拔有3 860 m，而青海血蜱恰是在高山地区分布的高原特有种。

4 结论

截至目前，共检测出2 种蜱，证明炉霍县至少存在微小扇头蜱和青海血蜱。共采集到成蜱820 只，其中青海血蜱29 只，占3.5%；微小扇头蜱791只，占96.5%，为优势种。微小扇头蜱为炉霍半农牧地区的优势蜱种，在采样的6 个半农牧乡均有分布。青海血蜱仅存在于雅德乡和旦都乡。