融合免疫荧光技术的共聚焦显微镜实验教学实践

刘如明， 边 鑫， 龙加福， 周 颖， 缴 莉

（南开大学生命科学学院，天津 300071）

0 引言

当今世界科技的发展日新月异，创新型科研人才在我国科技发展中起着关键作用［1-2］。高等院校承担着培养高素质研究人才的重任，对培养课程不断探索和创新改革才能紧跟时代发展的变化。而生命科学作为一门实验科学，先进的科学实验技术对培养创新型人才的科研能力尤其重要［3-4］。激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是生命科学研究中使用最为广泛的成像仪器，它在细胞生物学、遗传学、生物化学与分子生物学、生物医学、药学等学科研究领域起到不可或缺的作用，主要用于观察组织、细胞和亚细胞的微观结构，监测细胞生理活动、生物大分子间相互作用等。

LSCM实验教学课程有别于以操作为主的常规仪器培训，其目的在于帮助学生学习生物成像知识，掌握生物成像应用的实验方法，建立完善的生命科学研究体系。近年来，随着国家对生命科学研究的重视和经费投入的不断提高，越来越多的科研机构、高等院校和科技公司购置了LSCM。LSCM 技术作为普通光学显微镜技术的延伸，已成为生命科学相关学科学生们常用的实验技能之一，LSCM 实验课程的开设对学生实验教学特别是研究生的实验教学尤其重要［5-6］。自2012 年以来，本学院为研究生开设了LSCM 技术的实验教学课程“激光扫描共聚焦显微镜技术及应用”。结合本学院的科研情况和大型仪器教学特点，经过不断实践和优化，该教学课程将理论教学与实验教学相结合，并融合免疫荧光技术，构建了实验教学方案，这为提高学生们的科研素质和实验技能，对教学改革和学科建设都有着深远意义。

1 LSCM实验教学内容的构建

“激光扫描共聚焦显微镜技术及应用”依托于本学院研究生的必修课“现代生物学技术”，课程分为LSCM的理论课教学和实验课教学。理论课为大班集体教学，内容包括LSCM的发展前沿、技术原理、结构、高级荧光实验应用、显微镜发展前沿等；实验课分组循环教学，保证每位同学能够上机操作，在短时间内掌握仪器的基本操作和LSCM应用里的关键技术——免疫荧光实验技术，切身体会仪器的功能和应用。

1.1 多样化的展示技术构建理论教学课程

本课程面向生命科学专业的学生，在理论课程设计上，紧跟时代发展，探索性地引入多种先进技术，用多样化的教学方式使理论课程变得更加生动，更能调动和激发学生的学习兴趣［7-9］。在教学中将动画，视频，图片合理的融合在一起，兼顾了科学性和趣味性。比如，用虚拟全景技术制作了显微成像仪器室的VR介绍，给学生带来全新的真实现场和交互式的体验感受。同时，开展了网络教学内容制作工作。目前，网络教学成为信息化教学的重要组成部分。网络教学可以打破时间和空间的制约，使教学工作更加灵活。

理论课教学主要分四部分讲解。首先，带领学生认识LSCM，阐述LSCM发展前沿和光学原理，并通过与荧光显微镜成像原理的比较帮助学生们深刻地认识LSCM 的成像特点和优势。其次，以学院平台现有仪器为例，向学生介绍仪器的构造组成、仪器参数和功能。LSCM 主要用于观察荧光标记的样品，样品制备直接影响成像的质量。所以，之后的教学内容包括荧光成像基础和样品制备方法及注意事项。最后，给学生展示多种类型的应用实例，包括细胞、组织切片和植物样品的成像实验，活细胞实时观测实验，高级荧光实验（包括荧光共振能力转移和荧光漂白后恢复实验）等。由于LSCM 结果多以绚丽的图像和视频生动展示，配以数据分析，可以极大地提高学生探索的兴趣。

1.2 LSCM实验教学方式探索

LSCM属于使用率高的大型贵重精密仪器，和其他常规的生物学实验相比，在实验教学中存在以下问题：①仪器价格高，维修费用高昂，在教学实践中需要要做好仪器的维护工作；②仪器数量少，在有限的实验课时里无法保证每个人都上机操作；③仪器室空间有限，每次实验必须控制人数；④仪器操作比较复杂，短时间内没有办法掌握仪器的操作［10］。

针对以上问题，我们在多年组织课程实践中，及时总结经验，优化课程组织，遵循“专业教学-灵活参与-加强交流”的方式组织课程。

专业教师护航大型精密仪器LSCM的教学。实验课程授课教师为一线仪器管理教师，对仪器应用、管理有丰富的经验，在实验课程中能够保证学生正确使用仪器，并在课后对仪器进行维护，不额外增加仪器的维修费用。另外，显微镜管理教师掌握LSCM 的常规应用和高阶实验方法，不但能给学生讲透LSCM 的基本操作和应用，也能解答学生在显微镜应用中的各种疑难问题。

对于仪器数量少和场地有限的问题，实验课程“现代生物学技术”和其他实验课程一起，组织8 周的平行课程。每周4 学时，每次参加课程的学生为10 ～12 人。学院平台有两台LSCM可以提供给学生使用，并且有两名教师和一个助管老师带领学生进行实验。同学们根据课题研究需求和自己学业、职业的规划，通过选修灵活参加实验课程。

每一次实验课程先讲解基本操作，学生再分小组轮流上机操作。上机时学生可以自由组建互助小组，在老师的指导下进行操作。4 学时的实验课程对于部分初学者可能没有办法完全掌握LSCM的使用的。大型仪器实验课的目的不仅仅教给学生仪器技术和实验方法，也是学生和仪器教学老师交流联系的纽带。如果学生有更多关于仪器应用的需求可以随时到仪器平台进行学习，师生可以自由地交流仪器功能和实验方案。这对仪器平台来说也起到提高仪器使用率的作用。

1.3 间接免疫荧光实验与共聚焦技术结合教学

为了实验课的完整性，增加了间接免疫荧光制样的实验内容。免疫荧光技术是研究蛋白定位、蛋白间相互作用的重要研究方法［11-13］。对于生命科学类专业的学生而言，学习掌握免疫荧光技术及结果观察能够更顺利地开展相关科学研究工作。虽然实验课由于增加的内容变得紧凑，但是这部分课程对于学生能够完整的学习并掌握共聚焦显微镜实技术，切实参与到实验中，增强动手能力非常重要。

根据LSCM的使用特点，设计了实验教学内容，选用免疫荧光技术标记微管，DAPI 标记细胞核制备样品，然后利用共聚焦显微镜进行二维、三维图像采集。免疫荧光标记的样品具有存放一段时间再观察也不会淬灭的特点，因此可以提前制备好标准片供学生观察。在实际的实验教学中由两名教师带队，一边组织学生进行样品制备；一边有序地轮流观察前期制备好的标准片。这样既完善了实验教学内容，又解决仪器台数少的问题。此外，微管抗体是一款特异性好的商品化抗体，信噪比好，实验成功率高。选择标记微管作为实验内容，能够保证得到稳定清晰的实验结果，从而保证实验课程的效率［14］。

通过前期大量预实验，摸索出成熟实验流程和条件，保证同学们在4 学时内能够完成整个实验。教学实践中，免疫荧光实验和LSCM 上机可以交叉进行。先简单地向学生介绍实验方法和流程，仪器基本操作；接着，同学们开始按照实验方法进行免疫荧光实验。等待反应的间隙，同学们分组轮流进行成像采集和图像数据分析。

（1）实验材料和试剂。细胞：HUVEC细胞系。试剂：RPMI1640 培养基，胎牛血清，0.3%胰酶，Hank’s液，PBS，4%多聚甲醛溶液，Triton-100，牛血清白蛋白（BSA），单克隆小鼠抗Tubulin α抗体，标记FITC荧光素的山羊抗小鼠抗体（二抗），荧光防淬灭封片剂（含DAPI）。

（2）实验方法。贴壁的细胞直接培养在盖玻片上，培养1 d 后使细胞密度达到70%左右；取出盖玻片，轻轻地用PBS 浸洗2 次，勿振荡；将盖玻片取出浸没在新鲜配置的4%多聚甲醛溶液中，室温2 min固定细胞；吸去多聚甲醛溶液，PBS浸洗2 次后，吸去PBS，浸没在0.05%的TritonX-100/PBS 中透化5 min；吸去TritonX-100，PBS浸洗2 次，吸去PBS，用1%的牛血清白蛋白（BSA）/PBS，室温在湿盒中孵育30 ～45 min；吸去牛写清白蛋白，PBS 浸洗2 次，吸去PBS，用滤纸从玻片边缘吸去多余液体，滴加20 μL：100 稀释于1%BSA/PBS中的单克隆小鼠抗Tubulin α 抗体，放置于在湿盒中室温孵育2 h；PBS 浸洗3 次，每次5 min；吸去多余PBS，滴加20 μL 以1∶50 稀释于1%BSA/PBS中标记FITC荧光素的羊抗鼠抗体，孵育37 ℃45 min。PBS缓慢振荡浸洗3 次，每次10 min；取出盖玻片，吸去多余的PBS，在干净的载玻片上滴加5 μL 含DAPI的防荧光淬灭剂封片，然后用指甲油将盖玻片固定；使用激光扫描共聚焦显微镜观察采图，或者置-20℃冷冻保存。

（3）实验结果。HUVEC细胞，间接免疫荧光方法FITC标记微管，DAPI标记细胞核，使用激光扫描共聚焦显微镜ZEISS LSM710 观察，设置FITC通道，激发光488 nm，发射光495 ～550 nm，DAPI通道，激发光405 nm，发射光410 ～450 nm，63x 物镜，zoom3x，结果见图1。根据样品厚度进行层扫，扫描厚度4.6 μm，每层0.67 μm进行采图，见图2。结果通过软件ZEN 2011 BLACK进行投影重建，见图3。

图1 HUVEC细胞双重免疫荧光2D图像

图2 HUVEC细胞双重免疫荧光3D逐层扫描图像蓝色：DAPI标记的细胞核，绿色：FITC标记的微管蛋白

图3 HUVEC细胞双重免疫荧光3D投影重建蓝色：DAPI标记的细胞核，绿色：FITC标记的微管蛋白

2 实验课程的教学实践与思考

LSCM技术与应用课程的结合，打破以往单一演示仪器的教学方式，通过理论与实践有机结合［15］，样品制备与仪器应用联动的方式教学，使学生在学习仪器使用的同时，掌握显微镜样品的制作方法，充分认识到样品制备对成像结果的重要性。课程实践中，以学生为主体，老师为辅进行引导式教学。老师的职责在于启发学生遵循从“认知”到“实践”的学习规律，主动将理论应用到实际。学生在制样过程中亲自动手，逐步理解实验目的和成像原理，通过仪器成像的结果反过来分析和总结样品制备的细节和注意事项，两项技术有机结合分析，讨论和分析仪器参数和实验结果的相关性。

学生在进入实验室接受正式科研训练之前，提前掌握了大型成像仪器的基本操作和研究思路，可以帮助他们在研究生期间的科研训练中，发挥主观能动性，应用大型仪器开发新的研究，提高学生的实验素养和综合创新能力。

目前我们针对LSCM技术开设的这门实验课程主要作为子课程参加研究生必修课“现代生物学技术”，另外也参与本科生开放课“生物科学综合实验”实验教学（见表1）。随着共聚焦显微镜技术的成熟和广泛应用，课程也可以参与到细胞生物学实验课、免疫学实验课、生物化学和分子生物学实验课等课程的成像教学中，这对提升大型仪器使用率，培养学生科研创新思维，提高学科教学水平都具有重要意义。

表1 共聚焦显微镜在实验教学中的应用

3 结语

综上所述，笔者根据多年来共聚焦显微镜实验教学的经验，融合多种技术进行教学，将间接免疫荧光技术和共聚焦显微镜成像技术相结合，不断实践和优化，探索大型成像仪器行之有效的实验教学模式。共聚焦显微镜实验教学旨在助力学科高水平创新型人才培养，促进实验教学改革，提高大型仪器使用效率，服务学科建设。希望这一探索能够给大型仪器特别是贵重成像仪器实验教学带来新的启示，推动高校里的大型精密仪器应用教学。

·名人名言·

天才的最基本的特性之一——是独创性或独立性，其次是它具有的思想的普遍性和深度，最后是这思想与理想对当代历史的影响，天才永远以其创造开拓新的、未之前闻，或无人预料的现实世界。

——别林斯基