基于TLR4/NF-κB/ICAM-1信号通路探讨桑杏汤对急性肺损伤作用机制

程 慧,宋 侨

(襄阳市中医医院,湖北 襄阳 441000)

机体炎症反应和氧化应激失衡是造成急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的主要原因,临床表现为肺水肿、咳嗽咳痰、胸闷[1-2]。现代医学中急性肺损伤以对症治疗为主,如予以氨溴索注射液祛痰止咳,糖皮质激素抗炎[3]。而传统中医药治疗肺部疾病经验丰富,可以通过多途径、多靶点等特点发挥疗效[4]。

桑杏汤由桑叶、贝母、杏仁等8味中药组成,常用于治疗肺部疾病,具有润肺止咳,清宣温燥等功效。主要有效成分为苦杏仁苷、绿原酸、贝母素A、贝母素B、芦丁等[5]。本研究以桑杏汤组方为基础,结合其有效成分,以细胞因子释放为切入点,以急性肺损伤大鼠的炎性介质IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4/NF-κB/ICAM-1信号通路的影响为研究对象,探讨该组方对ALI的作用机制。

1 材料

1.1 药品

桑杏汤组成:桑叶3g,栀子皮3g,梨皮3g,香豉3g,浙贝母3g,沙参6g,杏仁6g。除梨皮外所有饮片购自襄阳市中医医院,经专家鉴定为正品,正常煎煮浓缩至50mL,相当于生药0.54g/mL。阳性对照药:甲泼尼龙片(批号:202603,天津天药药业有限公司)。

1.2 动物

SD大鼠40只,雄性,体质量(200±20)g,购于湖北省实验动物研究中心,许可证号:SYXK(鄂)2019-0009。

1.3 仪器与试剂

离心机(上海安亭科学仪器厂),旋转蒸发仪(河南御华科技公司),显微镜(梅特勒中国公司),酶标仪(美国BeckmanCourt公司),脂多糖(LPS)液(美国艾斯本技术有限公司,批号:AS1044),白细胞介素-6(IL-6),大鼠白细胞介素-1β(IL-1β),苏木素-伊红HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号G1220);肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA试剂盒(中生北控生物科技有限公司产品,批号:080831,091071,080621),兔抗NF-κB,TLR4,ICAM-1(美国ABCAM公司,货号:AB29849,AB17191,MRNA反转录试剂盒,荧光定量PCR试剂盒(上海生工生物科技有限公司);由上海生物工程有限公司设计合成的ICAM-1、TLR4、NF-κB引物。

2 方法与给药

2.1 动物造模与评价

2.1.1 动物分组与 ALI模型 40只雄性大鼠进行7天适应性喂养,共分为4组,每组10只,分别为空白对照组、模型组、桑杏汤组和甲泼尼龙组。各组大鼠除空白对照组外,均采用LPS的腹腔注射方法建立ALI模型[6-7]。空白对照组和模型组给予0.9%生理盐水,甲泼尼龙溶液浓度配置为0.4mg/mL,每组大鼠用1mL/100g的给药容积进行灌胃。

2.1.2 支气管黏膜病理学检查 4组每组随机抽取3只鼠类处死,取出支气管黏膜,生理盐水冲洗干净,擦干后固定在10%福尔马林溶液中,浸蜡脱水,包埋脱蜡切片,洗脱不同梯度乙醇,染色脱水封片,对气管支气管黏膜病理学变化进行显微镜下观察。

2.2 血清炎症因子检测

白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-1β (IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,按ELISA法在血清中检测。

2.3 Western Blot法定量检测TLR4/NF-κB/ICAM-1蛋白的表达方法

将肺组织切碎,匀浆,裂解,离心,电泳,加一抗4℃隔夜孵育,然后用TBST缓冲液洗净,再加相应的二抗,然后再用TBST洗涤洗净。利用化学发光法显色,用Image J软件测定各条带灰度值,以各样品与对应内参灰度值的比值来表示蛋白质相对含量。

2.4 PCR法检测TLR4/NF-κB/ICAM-1mRNA水平

采用TRIzol法先提取出大鼠肺部细胞中总RNA,并将总RNA逆转录为相应的cDNA,再以cDNA为模板,利用RT-qPCR法进行DNA扩增,PCR反应条件设置为50℃ 1min,95℃ 8min,95℃ 10s,60℃ 33s,40个循环。绘制溶解曲线,用2-△△Ct法绘制溶解曲线并进行资料分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 数据分析

3 结果

3.1 各组鼠肺组织HE染色结果

在空白对照组中观察大鼠支气管黏膜病理形态学变化,可发现大鼠支气管上皮细胞完整,各层结构清楚,没有炎症细胞;炎性细胞浸润可见于模型组大鼠支气管黏膜上皮细胞周围;大鼠气管支气管黏膜炎症浸润桑杏汤组和甲泼尼龙组,上皮细胞病变较模型组明显减轻,结果见图1。

图1 各组大鼠气管支气管黏膜组织发生的病理改变

3.2 支气管炎大鼠血清炎性因子受桑杏汤影响

与空白对照组比较,模型组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)(P<0.05,P<0.01)含量均有明显增加;桑杏汤组和甲泼尼龙组与模型组相比,大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(P<0.05,P<0.01)的含量均有明显下降,具体情况见表2。

表2 各组大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

3.3 桑杏汤对各组蛋白质表达的影响(TLR4,NF-κB,ICAM-1)

与空白对照组相比,模型组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB和ICAM-1的蛋白质灰度值和阳性表达率均有较大幅度上升(P<0.05,P<0.01);桑杏汤组、甲泼尼龙组大鼠肺组织与模型组相比,TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和阳性表达率均有较大幅度的降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),实验结果如表3所示。

表3 各组大鼠肺组织的水平比较(TLR4、NF-κB和ICAM-1)

3.4 桑杏汤对各组大鼠肺组织(TLR4,NF-κB和ICAM-1)mRNA的表达

与空白对照组相比,模型组大鼠肺组织中的NF-κB、TLR4和ICAM-1三种mRNA表达方式有显著提高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,NF-κB、TLR4和ICAM-1三种mRNA表达方式在甲泼尼龙组和桑杏汤组的大鼠肺组织中明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),实验结果如表4所示。

表4 大鼠肺组织中的TLR4、NF-κB和ICAM-1mRNA在各组的表达

4 讨论

中医治疗肺病经验丰富,源远流长,如张仲景创制的射干麻黄汤、小青龙汤、麦门冬汤等[8],起源于清代吴鞠通所著《温病条辨》的桑杏汤,具有止咳平喘、轻宣温燥等功效,是治疗温燥病证的经典方。临床中多用于治疗肺燥咳嗽、脉浮数、舌红少津等证。方剂由桑叶、杏仁、香豉、沙参、栀子、象贝、梨皮组成,其中桑叶、杏仁为主药,有效成分为苦杏仁苷、芦丁、贝母素甲、贝母素乙、绿原酸等,具有镇咳平喘、抗菌、消炎、抗氧化等功效[9-10]。

TLRS受体与I型白细胞介素受体结构同源,同时具有相同的信号转导途径,因此在免疫应答和炎性反应中具有极其重要的作用[11]。TLR4是TLRs受体之一,为识别脂多糖主要受体[12]。当TLR4受到LPS的持续刺激而激活下游的NF-κB信号通路枢纽位置时[13],NF-κB是一种重要的核转录因子,而细胞间黏附分子1(ICAM-1)属于黏附分子中免疫球蛋白超家族的一员,有研究表明ICAM-1的表达受NF-κB调控。故当机体发生炎症感染后,NF-κB 调控相关炎性因子并使其诱导、活化,促使相关抗原阳性白细胞黏附于ICAM-1 阳性内皮细胞表面,进一步到达炎症组织,促进炎症细胞的迁移和趋化进而导致 IL-1β、IL-6、 TNF-α等炎症因子过度表达与分泌[14]。

本研究中,大鼠经LPS诱导后,大鼠的炎症因子 IL-1β 和 IL-6、TNF-α的明显过度分泌。研究发现,IL-1β通过促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖、诱导宿主炎症反应和免疫应答[15],而 IL-6 是一种促炎细胞因子,能够直接参与机体的炎症反应,TNF-α是炎症启动因子,能够诱导、上调炎症细胞因子与趋化因子,促使炎症细胞侵入感染部位。

本研究通过ELISA检测法对大鼠外周血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量进行LPS诱导支气管炎模型检测,结果发现桑杏汤组能有效降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。采用Western Blot 和定量考察炎性介质 TLR4、NF-κB 和 ICAM-1等蛋白在模型大鼠肺组织中的表达情况,桑杏汤组肺组织中TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白和mRNA表达水平与模型组相比明显减少。同时HE染色结果也表明桑杏汤组可以减少肺组织的炎性浸润,缓解气道和肺部炎症症状。