三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑组织炎性损伤的改善作用及机制

钟瑞熙， 杜沅沁， 肖熹煜， 宋文选， 农耀斌， 朱荣火， 黄晶晶

1 广西中医药大学研究生院， 南宁 530299； 2 广西中医药大学第一附属医院脾胃肝病科， 南宁 530299；3 广西高发传染病中西医结合转化重点实验室， 南宁 530299

肝性脑病是慢性肝病和急性肝衰竭中常见且严重的并发症，其表现为广泛的神经或精神异常，包括仅能通过神经心理学或神经生理学评估检测到的轻度认知障碍到明显的定向障碍、意识模糊和昏迷［1］。乳果糖是肝性脑病的一线治疗药物，但其不良副作用包括呕吐、腹痛腹泻、脱水和电解质紊乱等，可能导致患者服药依从性下降［2］。因此迫切需要开发出一种高效且不良副作用小的治疗药物。三黄泻心汤由大黄、黄芩、黄连3味中草药组成，现代药理研究发现，三黄泻心汤具有抗炎［3］、抗菌［4］、改善出血症状［5］等作用。方中单味药大黄已被临床用于灌肠治疗肝性脑病，疗效可观［6］。因此，本研究通过观察三黄泻心汤对肝性脑病大鼠生理病理指标的影响，初步探讨其对肝性脑病大鼠脑组织炎性损伤的改善作用及机制，以期为制订肝性脑病的中医药临床用药治疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠30只，体质量（180±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［实验动物生产许可证编号：SCXK（湘）2019-0004，实验动物使用许可证编号：SYXK（桂）2019-0001］。饲养于广西中医药大学SPF级动物实验室内，室温24 ℃，12 h光照昼夜循环，空气流通，适应性喂养7 d，期间自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 三黄泻心汤由大黄12 g，黄芩、黄连各6 g组成，所用“农本方”颗粒由广西中医药大学第一附属医院中药房提供。引物设计及合成（北京擎科生物科技有限公司）；硫代乙酰胺（北京谨明生物科技有限公司，批号T70013）；TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批号ERC102a.96、ERC007.96、ERC003.96）；总蛋白提取试剂高效RIPA裂解液（北京Solarbio科技有限公司，批号R0010）；总RNA提取试剂trizo（l美国Invitrogen公司，批号155960296）；逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒（上海Novabio生物科技有限公司，批号F2202、F3528）；NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白抗体（美国Affinity公司，批号AF2006、AF5006）；β-肌动蛋白抗体、山羊抗兔二抗（安徽Biosharp科技有限公司，批号BL005B、BL003A）。

1.3 主要仪器 全自动生化分析仪Thermo Scientific Indiko（美国ThermoFisher公司）；紫外分光光度计NanoDrop（美国ThermoFisher公司）；荧光定量PCR仪qTOWER3G（德国Analytik Jena公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国ThermoFisher公司）；PowerPac Universal电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 动物模型的制备 C型肝性脑病是指发生于肝硬化等慢性肝损伤基础上的肝性脑病。本实验参考相关文献［7］采用四氯化碳（CCl4）复合法构建大鼠肝硬化模型：将CCl4、花生油按2∶3比例混合配置成40%CCl4油溶液后于模型大鼠皮下注射，每周2次，持续9周。首周每次注射5 mL/kg，而后每次注射3 mL/kg。实验期间搭配5%乙醇溶液自饮。之后采用硫代乙酰胺（TAA）法构建肝性脑病大鼠模型［8］：腹腔注射TAA溶液，连续3 d，1次/d，每次注射300 mg/kg。若大鼠出现反应迟缓、嗜睡、昏迷、共济失调、自主活动时间减少现象之一，即为造模成功。实验期间正常组大鼠正常饮食，造模大鼠造模成功后恢复正常饮食。

1.5 动物分组及给药剂量 30只SD大鼠采用随机数字表法完全随机分为正常组、模型组、乳果糖组、三黄泻心汤低剂量组和三黄泻心汤高剂量组，每组各6只。根据人与大鼠换算公式换算中药各组剂量，三黄泻心汤低剂量组含生药4.37 g/kg，相当于临床等效剂量的3.5倍；三黄泻心汤高剂量组含生药8.74 g/kg，相当于临床等效剂量的7倍；乳果糖组0.167 g/kg，相当于临床等效剂量的5.5倍。造模成功后，乳果糖组、三黄泻心汤低剂量组和高剂量组灌胃给予相应药物；正常组与模型组灌胃给予等体积生理盐水。给药持续7 d。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 大鼠一般状态观察及行为学检测 （1）实验过程中每天观察并记录大鼠的身体状况、精神状态、体质量、饲料消耗等情况。（2）Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力。将直径为1.5 m的黑色圆形水池（水温19～22 ℃）均等分为4个象限，每个象限制作1个不同的标记用于大鼠辨别定位，在某一象限设置1个直径10 cm的平台隐匿于水下2 cm处，将水池用遮光布围起，并在水中添加黑色颜料混匀，水池上方悬挂摄像机。定位巡航实验：每天定于固定时间段训练，训练期持续5 d。从池壁4个起始点的任一点将大鼠面向池壁放入水池。摄像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练将大鼠分别从4个象限放入水中。大鼠找到平台后或60 s内找不到平台（潜伏期记为60 s），则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10 s，再进行下一次实验。每日以大鼠4次训练潜伏期的平均值作为其当日的学习成绩。在造模后及给药后各进行一次正式的定位巡航实验。空间探索实验：定位航行实验结束后撤去平台，在原平台相对象限入水点将大鼠放入水中，记录其120 s内游泳路径并统计穿越平台次数。空间探索实验在给药后进行一次。

1.6.2 标本采集及病理切片制作 （1）按照体质量比给予大鼠腹腔注射等比例的2%戊巴比妥钠（0.03 mL/kg）深度麻醉，腹主动脉采血；取肝脏组织，截取回盲部后端结肠约10 cm，于冰上断头处死取脑组织，-80 ℃冰箱储存备用。（2）所采部分脑组织、肝脏组织浸入4%多聚甲醛固定液24 h，脱水后石蜡包埋切片，HE染色法染色。切片制作完成后在光学显微镜下观察（目镜10×，物镜20×）。选取目标区域进行拍照，分析。

1.6.3 大鼠血氨及肝功能指标测定 腹主动脉取全血后，取适量血液以肝素钠抗凝，用全自动生化分析仪检测各组大鼠血氨水平。取适量血液常温放置30 min后，以4 000 r/min离心10 min，分离上清液，保存于-20 ℃；用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中ALT、AST水平。

1.6.4 大鼠肠道pH值测定 准确称取结肠内容物重量，并以1∶8的稀释比例加入去离子水，用小型漩涡混匀器250 r/min混匀5 min，采用pH计检测大鼠肠道pH值。

1.6.5 酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平 取适量血液，根据ELISA检测试剂盒说明书进行操作。用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度。根据标准孔绘制标准曲线，并通过标准曲线公式计算各组大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.6 大鼠脑质量及脑组织中含水量测定 脑组织取出后用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，用滤纸吸干水分，称重并记录全脑质量（湿重量）。之后称取一部分脑组织，置于60 ℃烘箱中，72 h后称其干重量，计算含水量：含水量＝（脑湿重量-脑干重量）/脑湿重量×100%。

1.6.7 RT-qPCR检测大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达 采用trizol法提取各组大鼠脑组织总RNA后反转录为cDNA，以此为模板通过RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达量；GADPH作为内参对其进行标准化，2-△△Ct分析其表达水平。引物序列详见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6.8 蛋白免疫印迹法检测大鼠脑组织中NF-κB p65及其磷酸化蛋白的表达 取部分脑组织研磨后加入RIPA裂解液置于冰上裂解提取总蛋白，BCA法检测脑组织蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，经80 V（0.5 h）、120 V（1 h）恒压电泳后转至PVDF膜，封闭液封闭2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min；加入HRP标记的二抗（1∶4 000）常温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min；超敏发光液显影曝光显像，Image J软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验或Dunnett’s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠一般状态的影响正常组大鼠精神状况良好，动作敏捷；构建大鼠肝性脑病模型后，食欲不振，动作迟缓，皮毛发黄，生长发育迟滞，出现脱毛、嗜睡、昏迷等现象，极个别大鼠甚至共济失调。经乳果糖及低、高剂量三黄泻心汤灌胃治疗后，大鼠均出现腹泻症状，其中高剂量组程度较重；药物灌胃后大鼠食欲逐渐恢复，脱毛、嗜睡、昏迷现象减少。

2.2 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠肝脏病理学的影响 正常组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰、正常；模型组肝脏出现组织增生、肝小叶结构模糊、细胞排列紊乱、变性坏死、炎性细胞浸润严重等现象；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组肝细胞变性坏死、炎性细胞浸润、组织增生程度均得到改善，其中乳果糖组和三黄泻心汤高剂量组改善较明显（图1）。

图1 大鼠肝脏病理学改变（HE染色，×200）Figure 1 Pathological changes of rat liver （HE， ×200）

2.3 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠血氨及肝功能指标的影响 与正常组相比，模型组血氨水平及ALT、AST水平显著增加（P值均＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠血氨水平及ALT、AST水平均明显降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P值均＜0.05）（表2）。

表2 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠血氨及肝功能的影响Table 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on blood ammonia and liver function in rats with hepatic encephalopathy

2.4 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠肠道pH的影响与正常组相比，模型组肠道pH值增加（P＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠肠道pH值均降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P＜0.05）（图2）。

图2 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠肠道pH的影响Figure 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on intestinal pH in rats with hepatic encephalopathy

2.5 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 与正常组相比，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著增加（P值均＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P值均＜0.05）（表3）。

2.6 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑部的影响

2.6.1 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑部病理学的影响 正常组大鼠脑组织细胞结构正常完整、细胞核饱满。模型组大鼠脑组织细胞结构排列紊乱、坏死，细胞核固缩，胞质减少；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠脑组织细胞排列紊乱、坏死、细胞核固缩现象减轻，结构逐渐完整（图3）。

图3 大鼠脑部病理学改变（HE染色，×200）Figure 3 Pathological changes of rat brain （HE， ×200）

2.6.2 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠学习记忆能力的影响 与正常组相比，模型组大鼠寻台潜伏期显著增加，而穿台次数显著降低（P值均＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠用药后寻台潜伏期及穿台次数均明显改善（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P＜0.05）（表4）。

表4 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠学习记忆能力的影响Table 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on learning and memory ability of rats with hepatic encephalopathy

2.6.3 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑质量、脑组织含水量的影响 与正常组相比，模型组脑质量、脑组织含水量均显著增加（P值均＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠脑质量、脑组织含水量均降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P值均＜0.05）（表5）。

表5 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑质量、脑组织含水量的影响Table 5 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain mass and brain tissue water content in rats

2.6.4 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响 与正常组相比，模型组脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达均显著增加（P值均＜0.05）；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达均降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P值均＜0.05）（表6）。

表6 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响Table 6 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on mRNA expression of TNF-α、IL-1 β、 IL-6 on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy

2.6.5 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑组织中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组脑组织中NF-κB p65磷酸化水平显著增加；与模型组相比，乳果糖组和三黄泻心汤低、高剂量组大鼠脑组织NF-κB p65磷酸化水平均降低（P值均＜0.05），且三黄泻心汤高剂量组效果优于低剂量组（P值均＜0.05）（图4）。

图4 三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑组织中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达的影响Figure 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy in NF-κB p65 and its phosphorylated protein expression

3 讨论

肝性脑病可分为三类，A型为急性肝衰竭相关肝性脑病，B型为门静脉-体循环分流相关肝性脑病，C型为肝硬化相关肝性脑病［9］。目前研究［10］认为，高氨血症是肝性脑病的主要发病机制，而炎症反应、肠道微生态改变等多种机制可能共同参与并促进了肝性脑病发展。肝脏是人体最大的解毒器官，肝功能不全会导致血氨不能经尿素循环有效解毒，同时门体分流导致含有氨的门静脉血流直接流入体循环并进入脑组织［11］。另一方面，全身炎症反应可导致血脑屏障通透性增加，从而使氨及炎性因子更易进入脑组织，二者的协同作用导致星形胶质细胞肿胀，引起脑水肿［12］。同时，脑部积累的氨及炎性因子能够激活小胶质细胞及星形胶质细胞中的NF-κB通路［13］。NF-κB通路的激活则会介导大量炎性因子的转录和翻译，诱导脑部的炎症反应，加重脑部炎性损伤，引起脑实质改变和脑功能障碍［14-15］。此外，肠道微生态也与肝性脑病发病关系密切。肠道微生态失衡时，肠道中的优势菌生长被抑制，而内源性或外源性致病菌大量增殖［16］；小肠细菌过度生长则会导致肠道屏障完整性受损，促使细菌易位，释放氨和内毒素进入血液循环并最终使脑部受损［17］。有研究［18］报道，肝性脑病患者的肠道微生物群相较于健康人群改变较大，潜在致病微生物群的相对丰度更高，其认知能力检测和脑部MRI表现也更差，提示肠道微生态改变可能影响肝性脑病患者大脑功能。以上研究表明，肝性脑病是一种肝、肠、脑等多部位病变，多种机制协同致病的疾病，因此，有针对性的多靶点、多途径治疗手段或可有效改善肝性脑病患者脑部炎性损伤，进而对治疗肝性脑病产生积极作用［19］。

中医学并无“肝性脑病”病名，按其主要症状可归为“昏厥”“厥逆”“肝厥”一类。此病多由湿、痰、瘀、热诸邪交杂，上蒙清窍，元神失养所致，属虚实夹杂之病，治法多清热解毒，化痰开窍，兼以补虚［20］。三黄泻心汤出自张仲景《金匮要略》，全方由大黄二两、黄芩一两、黄连一两，共3味中草药组成，功可泻火解毒，燥湿泄热［21］。方中大黄、黄连归肝经，黄芩归胆经，清肝热，解肝毒，可减轻肝脏负担，改善肝脏功能；三药皆归大肠经，且重用大黄兼能泻下，可清洁肠道从而减少肠道内细菌及其代谢产物，并通过改变肠道微生态，减少氨的产生，促进氨的排出。全方针对肝性脑病“肝-肠-脑”轴发病的特点，从肝脏、肠道两方面着手治疗，有效减轻有害物质积累对脑组织的损害，可谓效宏力专。

本实验结果显示，相较于模型组，三黄泻心汤低、高剂量组大鼠肝脏病理切片中肝细胞变性坏死、炎性细胞浸润、组织增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST水平均显著降低，表明三黄泻心汤的使用有助于改善肝性脑病大鼠肝功能；三黄泻心汤低、高剂量组大鼠灌服药物后均出现不同程度腹泻，且肠道pH值较模型组降低并趋近正常组，产生与乳果糖类似的效果，提示三黄泻心汤可通过促进排泄及时清除有害物质，重塑肠道微环境并改变肠道微生态。以上因素的协同作用可能是导致三黄泻心汤低、高剂量组大鼠血氨水平较模型组明显降低的重要原因。另一方面，三黄泻心汤低、高剂量组大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平也较模型组显著降低，表明三黄泻心汤具有抗炎作用［22］。有关三黄泻心汤抗炎作用的研究［23］进一步表明，其发挥抗炎作用的有效成分主要是大黄酸、大黄素、黄芩苷、小檗碱等。已有研究［24］证实，氨与炎性因子在大脑中的积累会促进肝性脑病发生发展，并决定其严重程度。而三黄泻心汤可通过降低血液中氨与炎性因子水平以减少流向脑部的有害物质积累，进而减轻脑部的炎性反应，这将有助于改善肝性脑病大鼠脑组织炎性损伤。

三黄泻心汤对肝性脑病大鼠脑部的改善作用初步表现在：相较于模型组，三黄泻心汤低、高剂量组大鼠服药后嗜睡、昏迷等症状好转，其脑部病理切片中脑组织细胞排列紊乱、坏死、细胞核固缩现象减轻，结构逐渐完整；在检测大鼠学习记忆能力的Morris水迷宫实验中，三黄泻心汤低、高剂量组大鼠在寻台潜伏期与穿台次数方面较模型组明显改善。对脑组织的进一步检测显示，相较于模型组，三黄泻心汤低、高剂量组大鼠脑部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达，以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均显著降低，与以往的实验结果［25］相同。本研究结果表明三黄泻心汤可通过抑制肝性脑病大鼠脑部炎性因子转录及NF-κB p65磷酸化，有效改善肝性脑病大鼠的脑组织炎性损伤。

综上，本研究结果表明三黄泻心汤能改善肝功能及肠道微环境，减轻血氨和炎性因子在脑部积累所导致的炎性反应，从而有效改善肝性脑病大鼠脑组织炎性损伤，其作用机制与抑制肝性脑病大鼠脑部炎性因子转录水平及NF-κB p65磷酸化有关。本研究初步阐明了三黄泻心汤治疗肝性脑病的作用机制，为进一步研究三黄泻心汤治疗肝性脑病提供了实验依据，对于将传统中医药与科学技术相结合的中医药现代化事业也具有积极意义。但由于目前三黄泻心汤治疗肝性脑病的效果仍缺乏可靠临床研究支持，并需要明确不良反应与禁忌，故其临床应用和推广工作仍任重道远。

伦理学声明：本研究方案于2022年4月15日经由广西中医药大学实验动物伦理委员会审批，批号：DW20220408-054，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：钟瑞熙负责研究的思路设计及文章初稿撰写；杜沅沁对研究数据获取分析解释过程有关键贡献；肖熹煜、宋文选、农耀斌、朱荣火参与了研究数据的获取过程；黄晶晶负责指导撰写、修改文章及提供研究经费支持。