消栓通络片中三七茎叶及重金属检查*

卢旭波 周云峰 郭林峰 吴喆

消栓通络片是由桂枝、木香等11味中药组成的中药制剂,具有活血化瘀、温经通络的功效[1,2]。方中含有三七,用药部位为其干燥根和根茎[3]。然而三七属于名贵药材,不良商家为节约成本会将价格低廉的三七茎叶冒充三七进行投料生产[4-6],由于三七茎叶含有的化学成分与三七大致相同,这种违规行为一般难以发觉。另外,随着中药材野生资源日益枯竭,中药材商业化栽培种植逐渐得到推广,由于中药材的生长习性和人工干预,有相当部分的中药材出现重金属残留超标问题[7,8],这可能会引发质量风险,甚至将安全风险转移至中药制剂中,为了保证成品的疗效和用药安全,有必要对中药制剂的重金属进行限量检查。基于查阅文献几乎无对消栓通络片中三七茎叶和重金属有害元素检查研究的报道,本研究首次对消栓通络片中三七茎叶和重金属残留量进行检查分析,具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器及试剂CAMAG双波长紫外观察箱(瑞士卡玛公司);Nexlon 305D 电感耦合等离子体质谱仪(美国PerkinElmer公司);Mars 6 微波消解仪(美国CEM 公司);KH-250DB超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。正丁醇、醋酸、乙醚、甲醇为分析纯,浓硝酸为优级纯,水为蒸馏水。

1.2 试药三七皂苷R1(批号:110745-201921)、三七对照药材(批号:120941-201810)、三七茎叶皂苷对照提取物(批号:110871-202102)来自中国食品药品检定研究院;砷(As,批号:223004-2)、铜(Cu,批号:225017-7)的浓度均为1000 mg/L,来源于国家有色金属及电子材料分析测试中心;汞(Hg,批号:B22100008)、镉(Cd,批号:B21070285)、铅(Pb,批号:B22060242)的浓度均为1000 mg/L,来源于坛墨质检标准物质中心;金标准液(Au,批号:23-2AUY1)和铋、锗、铟、锂、钪、铽、钇内标液(Bi、Ge、In、Li、Sc、Tb、Y,批号:CL51-249CRY1)购于美国PerkinElmer公司;消栓通络片(15批,来源于7家企业,规格为0.38 g/片或相当于原药材1.8 g/片,批号分别为1812120、191203、480713、480712、470545、470158、20200301、20191202、20191104、20191003、20190802、20190702、180504、180302、20190502)。

2 方法与结果

2.1 三七茎叶检查

2.1.1 实验方法取样品5片,研细,加乙醚10 ml振摇10 min,滤过,弃去滤液,药渣挥干后用5 ml水润湿,加水饱和正丁醇10 ml,振摇提取10 min,浸泡2 h,取上清液,残渣再加水饱和正丁醇10 ml,振摇提取,取上清液,与第1次提取的上清液合并,用60 ml正丁醇饱和的水洗涤,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。 取三七茎叶皂苷对照物适量,加甲醇制成每1 ml约含10 mg的三七茎叶皂苷对照物溶液;取三七对照药材1.0 g,加70%甲醇20 ml,加热回流30 min,滤过,滤液浓缩至2 ml,作为三七对照药材溶液;取三七皂苷R1适量,加甲醇制成每1 ml约含2 mg的三七皂苷R1对照品溶液。照薄层色谱法试验[9],以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)放置分层的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10 %硫酸乙醇溶液,在110 ℃加热至斑点显色清晰,分别置日光下和紫外灯光(365 nm)下检视。

2.1.2 检测结果编号1～15为15批次消栓通络片供试品溶液,与三七对照药材及三七皂苷R1对照品相比,各斑点亮度、颜色及位置等均较一致;编号16为三七茎叶皂苷对照物,其与三七对照药材化学成分大致相同,如同样含有三七皂苷R1,但与样品和三七对照药材相比均多出现1个明显的斑点,能有效区分差异,说明该7家企业未出现三七茎叶冒充三七投料生产的违规行为。见图1。

注:A:在日光下检视;B:在紫外灯光365 nm下检视,1-15 供试品,16三七茎叶皂苷对照物,17 三七对照药材,18 三七皂苷R1对照品。图1 TCL色谱图

2.2 重金属残留量测定

2.2.1 对照品溶液的制备精密量取As、Cd、Cu、Pb、Hg标准物质适量,加5%硝酸溶液稀释成含As(0.5、2、5、10、50 μg/L)、Cd(1、5、10、20、50 μg/L)、Cu(10、40、80、100、250 μg/L)、Pb(1、5、10、50、100 μg/L)、Hg(0.2、0.5、1、5、20 μg/L)的混合标准溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取本品细粉约0.5 g,精密称定,置消解罐中,加入浓硝酸10 ml,静置2 h,经微波消解后将消解液转移至50 ml量瓶中,加入200 μl金元素标准溶液(1 μg/ml),加水稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。

2.2.3 仪器参数雾化气流量、等离子体气流量分别为0.95 L/min、18 L/min;电感耦合等离子体射频功率为1300 W;检测器双模式,Standard扫描模式;数据采集模式为跳峰模式,重复次数3 次;同位素202Hg 、208Pb 以209Bi 为内标,111Cd以115In 为内标,63Cu、75As 以89Y 为内标。

2.2.4 标准曲线 精密度与重复性采集一系列对照品溶液的响应计数值,以各标准物质与内标物计数值的比值为纵坐标(Y)、浓度为横坐标(x),绘制曲线方程;取1份混合标准溶液,连续进样6次,计算各标准物质与内标物计数值的RSD<4%;选择1批样品(样品序号:6),平行称取6份,按2.2.2项下方法处理,测定含量,各元素RSD<6%。见表1。

2.2.5 加标回收取样品(样品序号:6)约0.25 g,精密称定,置于消解罐内,精密加入相当于样品各元素含量100%的标准液,按2.2.2项下制备供试品溶液,平行制备 6 份,测定各元素的含量,各元素的回收率。见表2。

表2 加样回收率

2.2.6 样品测定消栓通络片样品中As、Cd、Hg、Cu和Pb的含量见表3。按照中国的重金属有害元素限量[15]：Cu≤20 mg/kg、Pb≤5 mg/kg、As≤2 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg,样品中有1批Hg超标,2批As超标。

表3 消栓通络片中5种元素测定结果 (mg/kg)

2.2.7 风险评价重金属进入人体易在皮肤、肝脏、肾脏等蓄积造成中毒损伤[10],从2.2.6项下测定结果可知,有部分样品的重金属含量超过限度值,这有必要对不同企业的15批样品的整体安全风险进行评估。采用中国食品药品检定研究院发布的中药中外源性有害残留物安全风险评估技术指导原则(Guideline of risk assessment of exogenous harmful residues in traditional Chinese medicines, GRAEHRTCM)和美国环境保护署(Environmental Protection Agency,EPA)推荐的健康风险评估(Health risk assessment,HRA)2种模型对安全风险进行分析:(1)GRAEHRTCM模型:①HI=IR×C×EF×Ed×10/(AT×W×HBGV) ,式①中,IR为制剂每日服入最大值,为6.84 g;C 为所有样品某重金属含量的平均值(mg/kg);EF为中药制剂的暴露频率,指导值为90 d/年;Ed为中药服用年限20年;AT为平均寿命天数,指导值为25550 d;W为人体体质量,成年人体质量以63 kg计;10为安全因子;HBGV为重金属的健康指导值,As、Cu、Hg、Pb和Cd的HBGV 分别为2.1、50、0.57、3.6、0.83 μg/kg[10]。若HI>1,风险出现概率较高,需要关注。通过计算,Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI分别为0.003、0.245、0.010、0.009、0.012,均小于1,且5种元素的HI叠加值为0.279,低于安全阈值[11]。(2) HRA模型:②HI=(F×C/BW)/ADI,式②中,F 为消栓通络片每日服用量,同式①中的IR; C 为药品某重金属的残留值,同式①;BW 是人体质量,此处采用国际通用标准成人为55.9 kg;ADI 同式①中的HBGV 。经算Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI值分别为0.005、0.393、0.016、0.014和0.018。5种元素的风险大小顺序依次为As>Pb>Cd>Hg>Cu,5种重金属的叠加风险值HI为0.446,小于1,提示该品种残留的5种重金属元素产生的安全风险较小[12]。

3 讨论

中国药典以人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1[3]对消栓通络片中的三七进行了定性定量控制,这对三七原料的质量控制起到了一定作用,然而相对于多年生的三七根资源,三七茎叶资源易得、价格便宜,且均含有三七根的上述3种成分[13,14],不法企业便有可乘之机,以三七茎叶冒充掺伪三七根投料生产,达到以假乱真、以次充好之效。为遏制这种不法行为,不少科研者对含三七的中药制剂的三七茎叶检查方法进行了研究,范可青等[15]采用HPLC法对复方丹参片中三七茎叶进行检查,通过比对三七茎叶、三七根和制剂色谱峰的差异评估该制剂三七的掺伪情况。相比于HPLC法,薄层色谱法快速、简便、检测成本低,本研究首次采用薄层色谱法建立了消栓通络片中三七茎叶的筛查法,该法也可有效区分三七与三七茎叶的差异,能准确判断消栓通络片中是否存在三七茎叶冒充三七投料行为,可作为该制剂质量控制补充检验方法的一种借鉴。

Hg、Pb中毒严重影响中枢神经系统[16],As、Cd具有明确的致癌、致畸及致突变作用[17-19],中药制剂若重金属含量过高,可能会良药变成毒药,这有必要对中药制剂中多种重金属有害元素残留量进行监测。本研究采用ICP-MS法测定消栓通络片中5种重金属残留量,并首次采用GARM和HRA 2种模型对其重金属可能导致的安全风险进行分析,结果表明所抽取的样品整体上重金属残留量较低,出现安全风险的概率较低。但需要注意的是有个别生产企业样品重金属残留量超标问题,如A企业样品(批号:1812120)中As的含量是限量值的44倍以上,这有可能会超过人体耐受值,造成中毒损伤。该制剂的现行标准中无重金属检查项,部分生产企业在该制剂生产过程中可能会忽视外源性重金属带来的污染,为有效降低重金属所致的安全风险,建议在现行标准中补充重金属检查项。