基于QuEChERS-高效液相色谱法测定油炸食品中丙烯酰胺含量

董文静 戴尽波 聂荣荣 沈 洁 叶彩平 蔡智涛

(梅州市食品药品监督检验所,广东 梅州 514071)

丙烯酰胺(acrylamide)为不饱和酰胺[1],其单体具有多种毒性及潜在致癌性[2-3]。丙烯酰胺暴露量0.000 5 mg/kg为常人每天允许的最大暴露量。世界卫生组织(WHO)指出,丙烯酰胺对神经系统有明显的损伤作用[4],具有神经毒性[5]。国际肿瘤机构(IARC)将其认定为2A类致癌物[6]。

丙烯酰胺广泛存在于各种食品中,尤其是经高温加工的富含淀粉类食品,其含量远远超过饮用水中规定的限量(0.5 μg/kg)[7]。2002年瑞典国家食品管理局与斯德哥尔摩大学研究人员[8]在一些油炸和烧烤的淀粉类食品中检测到丙烯酰胺, 之后英国、挪威、美国、澳大利亚、新西兰、加拿大等国家也报道了类似检测结果[9-10]。2019年5月,国家食品安全风险评估中心将丙烯酰胺的风险监测纳入2020年食品安全风险监测计划之中[11]。油炸食品中丙烯酰胺含量最高[12],一般在加工温度高于100 ℃时才会产生丙烯酰胺,且随着高温烹饪时间的延长丙烯酰胺的生成量逐渐增多[13]。

食品中丙烯酰胺的检测方法通常有液相色谱法、液相色谱—质谱法、气相色谱法、气相色谱—质谱法、光谱法等。气相色谱及质谱联用技术需对分析物进行衍生化处理,前处理操作复杂,相对费时,不适宜大批量的处理分析。液相色谱—串联质谱法可有效排除检测物中杂质的影响,回收率较高,但对仪器要求高。液相色谱在传统反相吸附柱中选择性略低,适用于油炸、烘烤等丙烯酰胺含量高的食品检测[14-21]。QuEChERS法是一种快速、简便,对试验器材和试剂要求不高的前处理方法。林涛等[22]使用QuEChERS结合超高效液相色谱—串联质谱法测定了咖啡中丙烯酰胺含量;欧阳小艳等[23]使用QuEChERS结合超高效液相色谱—电喷雾串联四极杆质谱测定了焙烤蛋糕中的丙烯酰胺含量。研究拟将新型材料碳十八碳键合锆胶(Z-Sep+)与C18应用于油炸食品中丙烯酰胺测定的前处理中,建立一种采用QuEChERS方法进行前处理,高效液相色谱和二极管阵列检测器进行测定的检测方法,以期为油炸食品中丙烯酰胺的筛查监测工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、丙酮、甲醇:色谱纯,美国ACS恩科化学;

C18:40～60 μm,天津博纳艾杰尔科技有限公司;

PSA:天津博纳艾杰尔科技有限公司;

Z-Sep+:美国Supelco公司;

丙烯酰胺标准品:1 000 μg/mL,农业部环境保护科研监测所;

饼干中丙烯酰胺分析质控样品:MRM0276,北京美正检测技术有限公司;

炸薯片:乐事薯片有限公司;

炸芋圆、炸馓子、炸南瓜圆:市售。

1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪:LC-20AT型,配备SPD-M20A二极管阵列检测器,日本岛津公司;

电子分析天平:AUW220型,日本岛津公司;

全自动平行浓缩仪:AutoEVA-60型,睿科集团股份有限公司;

高速冷冻离心机:ST16R型,美国Thermo Fisher公司;

调速多用振荡器:HY-4型,金坛市宏华仪器厂;

超纯水系统:Milli Q型,美国Millipore公司。

1.3 样品前处理

油炸食品经高速粉碎机粉碎后过40目筛,于-18 ℃贮藏备用。称取2 g经粉碎后的油炸食品,加入10 mL正己烷脱脂,7 000 r/min离心5 min,弃去上层清液,待样品中残余正己烷完全挥发后加入10 mL甲醇,振摇30 min,7 000 r/min离心5 min,吸取8 mL上清液,加入150 mg Z-Sep+及200 mg C18,涡旋净化1 min,7 000 r/min离心5 min,吸取7 mL上清液,室温氮吹至干,用1 mL超纯水复溶,过0.45 μm尼龙66滤膜,上机待测。

1.4 色谱条件

色谱柱为Capcell PAK C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇,流动相B为超纯水;柱温25 ℃;流速1 mL/min;进样量10 μL;检测波长197 nm;等度洗脱比例:5% A+95% B。

2 结果与分析

2.1 净化材料的选择

采用Plackett-Burman试验(n=12),考察PSA用量、C18用量、Z-Sep+用量 3个因素在QuEChERS前处理方法中的净化效果,试验因素水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平

由表2可知,单独使用PSA净化时,回收率最低,甚至低于未使用净化材料的对照组,随着Z-Sep+和C18的加入,回收率有不同程度的上升,Z-Sep+和C18配合使用的回收率高于单独使用时的。为了更直观地体现3种净化材料的使用对回收率的影响,运用Minitab 18软件对表2数据进行分析处理,以回收率作为响应值,结果用标准化帕累托图表示(见图1)。

基准参照线表示99%置信区间(P<0.01)

由图1可知,C18和Z-Sep+的标准化效应值超过了基准参照线,表明这两个因素对回收率影响显著,影响丙烯酰胺回收率因素显著性为C18> Z-Sep+。与未使用Z-Sep+的处理组相比,使用Z-Sep+处理后的色谱图杂质峰更小;而使用PSA处理后,在紧挨着丙烯酰胺色谱峰的位置之后出现了一个巨大的杂质峰,可能是PSA本身引入的杂质,导致信噪比与回收率降低。后续试验以C18和Z-Sep+两种因素作为主要因素进行优化。

2.2 净化材料比例与提取溶剂的选择

在单因素试验基础上,对C18用量、Z-Sep+用量、提取溶剂的选择进行正交试验设计。由于丙烯酰胺属于食品中内源性污染物[24],为充分考察待优化因素的真实提取效率和净化效果,使用丙烯酰胺分析质控样品作为试验样品,以测量值与质控样品真实值间的误差准确度,误差越小,代表准确度越高。试验因素水平见表3,试验设计及结果见表4。

表3 正交试验设计因素与水平

表4 正交试验设计与结果

由表4可知,以乙腈作为提取溶剂时误差普遍偏高,说明以丙酮或甲醇作为提取溶剂更合适。当C18用量提高时,误差的变化趋势逐渐减小;当Z-Sep+用量变化时,误差的变化趋势不易直观看出。为了更直观地体现两种净化材料在不同用量时对误差的影响,以及不同提取溶剂对试验结果影响的优劣程度,使用SPSS软件对试验结果进行方差分析,以准确度的估算边际均值为纵坐标,单因素变量为横坐标,绘制方差的单变量分析图如图2所示。

图2 准确度与提取溶剂、C18用量、Z-Sep+用量的方差分析图

由图2可知,当Z-Sep+用量增大时,误差反而升高,可能是由于过量Z-Sep+吸附了部分待测物使结果偏离真值。当C18用量为50～200 mg时,误差随C18用量的增加而减小,说明C18对油炸食品中杂质的吸附效果较好,在此范围内增加C18用量可以有效减少结果误差。C18和Z-Sep+吸附的杂质种类不同,配合使用时可净化样品中大部分杂质,净化效果优于单独使用。使用甲醇作为提取溶剂时,提取效率最高,误差最小,丙酮其次,乙腈的提取效率最低。因此,最佳提取条件为甲醇为提取溶剂,Z-Sep+用量75 mg, C18用量200 mg。

2.3 流动相比例的选择

预试验发现,甲醇—水、乙腈—水均有较好的分离效果,试验选择甲醇—水为流动相,通过考察不同体积比(V甲醇∶V水为30∶70,20∶80,10∶90,5∶95,2∶98)下甲醇—水的分离效果来确定最佳的流动相比例。

由图3可知,随着流动相中水所占比例的升高,丙烯酰胺的保留时间也逐渐后移,当V甲醇∶V水为30∶70～10∶90时,丙烯酰胺的保留时间为2～4 min;当V甲醇∶V水上升至5∶95时,丙烯酰胺的保留时间为4.302 min;当V甲醇∶V水为2∶98时,丙烯酰胺的保留时间为4.928 min。由图4可知,样品中的杂质峰主要集中在2～4 min,丙烯酰胺保留时间若晚于4 min有利于待测物与杂质更好的分离。当V甲醇∶V水为5∶95时,丙烯酰胺峰面积最大,响应值最高。常立伟等[25]采用高效液相色谱法测定薯条中的丙烯酰胺,所用流动相V甲醇∶V水为0.5∶99.5,与试验结果接近。但试验发现,水的比例并非越高越好,结合保留时间与响应值,选择V甲醇∶V水为5∶95作为丙烯酰胺检测的流动相。

图3 不同流动相比例下液相色谱图

图4 QuEChERS法提取炸芋圆中丙烯酰胺的高效液相色谱图

2.4 检测波长的选择

由图5可知,丙烯酰胺在190～250 nm处均有吸收,最大吸收波长为197.56 nm。通过不同波长下标准曲线的响应值与信噪比也可看出,197 nm下丙烯酰胺的峰面积与信噪比最大。因此,选用197 nm作为丙烯酰胺的检测波长。

图5 丙烯酰胺在190～300 nm的吸收光谱图

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系、检出限和定量限 配制质量浓度为0.1～2.0 mg/L的一系列丙烯酰胺标准溶液,按1.4的色谱条件进行测定。以丙烯酰胺峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标,绘制丙烯酰胺的标准曲线方程为Y=92 039.8X+1 068.39,R2=0.999 4,检出限为0.007 mg/kg,定量限为0.02 mg/kg,与GB 5009.204—2014中规定的定量限(0.01 mg/kg)接近,且大大简化了使用仪器和前处理过程,可以满足日常油炸食品中丙烯酰胺含量的筛查与监测。

2.5.2 精密度和稳定性 称取6份丙烯酰胺质控样,按1.3的方法进行前处理,结果表明,该方法相对标准偏差为0.66%,重复性良好。

选取一份待测样品,分别在制备后的0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h时进样测定,结果显示丙烯酰胺的日内精密度为1.00%,表示样品溶液在24 h内基本稳定。选取一份待测样品,分别在制备后的0,1,2 d进样测定,结果显示丙烯酰胺的日间精密度为0.14%,表示样品溶液可在3 d内保持稳定。

2.5.3 回收率 在丙烯酰胺质控样中添加丙烯酰胺标准溶液,根据国家食品安全风险评估中心发布的《食品中丙烯酰胺的危险性评估》中列出的不同食品的丙烯酰胺含量可知,大部分油炸食品的丙烯酰胺含量为0.2～1.0 mg/L。试验在0.2,0.5,1.0 mg/L 3个水平下进行加标回收试验,结果见表5。

表5 丙烯酰胺的回收率和相对标准偏差

由表5可知,当加标量为0.2～1.0 mg/L时,样品回收率均>90%,RSD均<2%,说明试验方法回收率良好,精密度高,结果稳定。

2.6 实际样品测定

由表6可知,4种不同食品基质的油炸食品中,以土豆片为基质的炸薯片中的丙烯酰胺含量最高,其次是以南瓜丝为基质的炸南瓜圆,两种炸品的丙烯酰胺含量均>0.5 mg/kg。以芋头丝为基质的炸芋圆中的丙烯酰胺含量相对较低,含量最低的为以小麦粉面团为基质的炸馓子。食品原料对油炸食品中丙烯酰胺含量的影响为土豆片>芋丝>南瓜丝>面团。由于南瓜含有天然色素,导致炸南瓜圆的样品提取液颜色较黄,经净化后颜色变浅,并未影响试验结果,说明试验方法对含有一定量色素的样品同样具备较好的检测能力,可以适应多种不同油炸食品中丙烯酰胺含量的检测。

表6 不同油炸食品中丙烯酰胺含量

3 结论

研究采用新型材料碳十八键合锆胶(Z-Sep+)结合C18作为净化材料应用于油炸食品中丙烯酰胺含量的测定,建立了一种简便、高效的QuEChERS前处理方法。与传统方法相比,试验方法打破了丙烯酰胺检测中使用QuEChERS前处理必须配备质谱检测器的固定模式,在简化前处理过程的同时,降低了对仪器的要求,可以满足日常对油炸食品中丙烯酰胺的筛查监测工作,尤其适合仪器条件有限的基层检测单位和一些经费有限的研究机构进行油炸食品中丙烯酰胺含量的科研监测工作。后续可以此为延伸,对净化材料进行更多的调整,为其他食品中丙烯酰胺含量的测定提供依据。