内质网应激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管内皮细胞损伤中的作用

浮凤洲 （广东省东莞市松山湖中心医院,广东 东莞 523320）

柚皮苷（Naringin）作为一种双青黄酮类化合物，可在柑橘、葡萄柚果皮、酸橙果皮中进行提取[1]。随着社会的高速发展，人们的生活方式有了很大的变化，我国糖尿病的患病人数有了大幅增加。糖尿病患者在进行代谢的过程中可能会引起血管内皮细胞的损伤[2]，对于内皮细胞线粒体ROS的生成具有重要的作用。有相关研究[3]证实，Naringin在糖尿病的心血管并发症中具有一定的保护作用，主要表现在调控GSK3β通路、线粒体保护以及抗ERS作用，在产生保护作用后，会引起多种伤害的刺激，从而引发细胞损伤[4]。由于内质网应激/GSK3β是糖尿病患者血管内皮细胞损伤的重要发病机制，可以将其当作内皮细胞损伤的关键环节，也将其当作是Naringin防治的重要靶标。近年来，糖尿病已经成为了危害心血管疾病的独立因素之一，成为了世界卫生发展重要难题[5]。糖尿病产生的主要危害来自于并发症，可引起视网膜病变、肾脏病变等[6]。本文基于此，探讨了内质网应激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管内皮细胞损伤中的作用，具体内容如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 本次试验的试剂、仪器等包括：血管内皮细胞（上海雅吉生物科技有限公司），柚皮苷（美国Sigma公司），内质网抑制剂四本基乙酸（4-Pheny1 Butyrie Acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP竞争性GSK-3β抑制剂）（赛百慷生物科技股份有限公司），胎牛血清（PAN公司），培养基（Hycolone公司），逆转录试剂盒（Roche公司），GSH试剂盒（武汉吉立德生物有限公司），ROS试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），NO试剂盒（南京建成生物科技有限公司），DNA逆转录试剂盒（Thermo公司），细胞凋亡试剂盒（Beyotime公司），IL-6（Interleukin-6）、NF-kB（Nuclear Factor-Kappa B）、GRP78（Glucose Related Protein）、Caspase3、CHOP都购买自Abcam公司，细胞培养箱（力申科学仪器有限公司），Nano Drop 2000（Thermo公司），离心机（Sigma公司），40mmol/L葡萄糖（Hyclone公司）[7]。

1.2 方法

1.2.1 细胞计数测定方法 首先在孔板中将细胞悬液进行配置，并放在培养箱中培养24h，在培养基中加入不同浓度的多肽，因为CCK-8的量比较少，所以在孔壁上可能会带来一定的误差，因此在培养板中要进行敲击，从而充分的混匀。在培养了1-4h后，就可以对其进行细胞凋亡率及细胞存活率的检测，检测的波长一般为450-490nm左右[8]。

1.2.2 DCFH-DA染色法检测活性氧及GSH试剂盒检测 用无血清培养基进行阳性稀释，让浓度达到100uM，如果刺激时间较短，还需要先装载探针。若刺激时间较长，就后装探针[9]。本次试验的刺激时间较长，所以选择后装探针。在细胞培养的过程中，对细胞的状态进行检测，并对其进行清洗和诱导，于37℃环境下对细胞进行避光培养，离心后去除上清液，对细胞收集后即可使用荧光分光光度计进行检测。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸所组成的，将0.05g的细胞种子放入5%的三氯乙酸中进行研磨，离心10min后取上清液，标准溶液使用5%的三氯乙酸并选用pH为7.8的PBS，充分的混匀后，在30℃的条件之下保温5min后即可进行检测。

1.2.3 ELISA试剂盒检测及免疫印迹法检测 将所需的板条数放入到框架之中，建立空白孔，加入TMB显色液及终止液，通过对照实验画出相应的曲线。将浓度不同的标准品加入到孔中，使用封板胶纸封住在室温下培养2h。随后清洗板条，并在每个空白孔中加入100ul的工作液，于室温下培养1h。随后加入酶结合物[10]，培养20min。加入显色剂后继续培养20min，最后加入终止液充分搅拌后即可检测IL-1β、IL-6、IL-8。

免疫印迹法需要进行细菌诱导和表达，借助电泳的方式将细胞裂解，在真核细胞中加入匀浆缓冲液，在室温下加匀浆，在13000r下离心15min，取上清液进行转膜。在免疫反应中，选择0.01PBS洗膜，持续时间5min[11]，加入包被液后均匀摇动，在室温下培养2h。加入一抗液体，需要将膜全部覆盖，在4℃的条件下放置12h，通过阴性对照的方式进行培养。最后加入显色液，终止反应后即可进行检测[12]。

1.2.4 JC-1染色法测定 首先诱导细胞凋亡，并同时设立阴性组和阳性组，在适当的时间之内对其进行Caspase检测，将细胞进行收集。使用PBS洗涤液对细胞离心5min，去细胞上清液后加入水稀释，将其加热到37℃。吸入500g/L的incubation Buffer，加入JC-1混匀成为JC-1工作液。将工作液放入细胞中，让细胞悬浮，并于37℃下在培养箱中培养20min。随后在2000rpm下离心5min。最后使用流式细胞仪对数据进行检测[13]。

1.3 统计学分析 本次研究所涉及统计学数据资料均利用SPSS21.00软件进行处理计算，其中计量资料选择t检验，计数资料采用卡方检验，当计算结果得出P＜0.05则表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率检测结果 研究结果表明，正常对照组细胞的存活率为100%，高糖组的细胞存活率为（70.36±6.31）%，柚皮苷+高糖组的细胞存活率为（86.44±5.80）%，可以看出，在不进行任何干预的情况下，细胞存活率不会受到任何影响。而柚皮苷+高糖组的细胞存活率明显高于高糖组（P＜0.05），说明柚皮苷在高糖引起的血管内皮损伤中具有保护作用。

2.2 氧化应激检测结果 氧化应激主要测试细胞的活性氧（ROS）以及GSH水平，由于使用的DCFH-DA探针没有荧光，所以在酯酶水解后会形成DCFH，难以透过细胞膜。研究结果表明，高糖组的ROS含量明显高于正常对照组，且相较于高糖组，柚皮苷+高糖组的柚皮苷浓度有所增加，ROS含量降低。

2.3 细胞凋亡检测结果 在细胞凋亡中，正常对照组的细胞凋亡率最低，为（20.77±3.08）%，高糖组的细胞凋亡率为（42.71±8.12）%，明显高于柚皮苷+高糖组的（24.01±4.22）%。这说明柚皮苷对于细胞凋亡有着保护的作用。

2.4 炎症因子检测结果 在炎症因子的表达中，相较于正常对照组，高糖组的NF-kB、IL-6表达有所升高（P＜0.05）。相较于高糖组，柚皮苷+高糖组的IL-6、NF-kB有所下降。如表1所示。

表1 三组炎症因子检测结果比较

2.5 线粒体损伤检测结果 为了验证线粒体损伤的检测结果，分别加入内质网应激抑制剂四苯基乙酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP竞争性GSK-3β抑制剂），观察血管内皮细胞毒性的作用。研究结果表明，正常对照组MMP和细胞色素C表达明显高于高糖组（P＜0.05），而4-PBA组、TDZD-8组、4-PBA+高糖组及TDZD-8+高糖组明显高于高糖组。这说明4-PBA、TDZD-8对血管内皮损伤有保护作用。见表2。

表2 各组线粒体损伤检测结果

2.6 eNOS表达及NO检测结果 研究结果表明，相较于高糖组，柚皮苷+高糖组的柚皮苷浓度增加，NO含量也在增加。可是相较于对照组，高糖组的NO含量明显降低。

3 讨论

糖尿病（Diabetes）是临床常见的慢性疾病，受到许多外部因素的影响，导致患者自身的代谢处于紊乱状态[14]。临床上主要以高血糖为主要表现，还可出现多尿、多饮、多食、消瘦的情况。糖尿病会引发许多其他的并发症，严重的还有可能引发器官衰竭，是一种无法治愈的疾病[15]。在本次实验当中，探讨了内质网应激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管内皮细胞损伤中的作用。研究结果表明，在不受到任何干扰的情况下，细胞的存活率较高、凋亡率较低，建立了葡萄糖高糖模型后发现，高糖组的细胞存活率较低，凋亡率较高，但是发现柚皮苷能够有效地对血管内皮细胞产生保护作用，有效提高细胞存活率，降低凋亡率，且降低了ROS含量。在炎症因子检测结果中，柚皮苷+高糖组的IL-6、NF-kB相较于高糖组有所下降。4-PBA、TDZD-8对线粒体损伤有保护作用。

综上所述，柚皮苷在内质网应激/GSK3β通路下对高糖引起的血管内皮损伤具有保护作用，且4-PBA、TDZD-8可以起到抑制作用，其中的作用机制可能与炎症因子、细胞凋亡有一定的关系，因此，临床治疗中如果有效地抑制炎症因子释放，可能会产生较好的临床效果。