利拉鲁肽对高糖环境下牙周膜成纤维细胞凋亡的影响

崔丽娟，刘海霞，刘洁莹，李桂平

（广州医科大学附属惠州医院内分泌科，广东 惠州 516002）

牙周病是一种常见的口腔疾病，主要因牙菌斑内细菌及代谢产物破坏牙周支持组织，导致牙龈炎症或出血、牙齿松动的病症，严重者可引起牙齿移位或脱落。牙周膜成纤维细胞（PDLF）是牙周组织中一种重要的多能细胞，通过不断生长分化形成新的纤维和牙骨质，参与牙周组织的修复过程，对维持牙周膜完整性具有至关重要的作用[1]。有多项研究显示，高血糖会刺激PDLF 产生炎症因子，促进细胞凋亡，加剧牙周组织的破坏，进而诱发牙周疾病[2-3]。糖尿病合并牙周疾病患者，当血糖状况得到有效控制后，配合牙周局部基础治疗，牙周病变会明显好转，但在实际临床上，部分患者血糖控制不佳，牙周基础治疗无法顺利开展，因此，研究高糖环境下牙周损伤的修复具有重要意义。利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，主要用于二甲双胍或磺脲类药物控制不佳的糖尿病患者的治疗。有报道称，利拉鲁肽能够降低血糖、减轻炎症反应、改善心血管功能[4]，但其对糖尿病合并牙周疾病的影响报道较少。基于此，本研究通过体外培养人牙周膜成纤维细胞，观察利拉鲁肽对高糖环境下细胞凋亡及炎症因子的影响，探讨利拉鲁肽对糖尿病合并牙周疾病的保护机制，为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料利拉鲁肽注射液（丹麦诺和诺德公司，国药准字J20160037，规格：3 mL∶18 mg）， DMEM培养基（美国Gibco 公司），胎牛血清（美国Gibco 公司），胰酶（美国Sigma 公司），碘化丙啶（PI）染液（美国BD 公司），Matrigel 胶（美国BD 公司），磷酸盐（PBS）溶液（武汉赛维尔生物科技有限公司），流式细胞仪（美国BD 公司，型号：FACSCanto），二氧化碳（CO2）培养箱（深圳市瑞沃德公司，型号：CIB-191C），台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器有限公司，型号：L 500），倒置荧光显微镜（广州微域光学仪器有限公司，型号：WSF-1600）。

1.2 原代细胞培养牙周膜组织标本来源于口腔科，选取2019 年12 月广州医科大学附属惠州医院接受正畸治疗需拔出的前磨牙的5 名志愿者。纳入标准：①年龄≥ 18岁；②牙周健康，无龋齿、牙体缺损或牙髓疾病；③无基础病史，近3 个月内未服用过激素或影响血糖的药物；④对研究知情并签署知情同意书。患牙拔出后用含有双抗的PBS 缓冲液反复冲洗，在无菌条件下锐性刮取牙根中部1/3 处牙周膜组织。将获取的牙周膜组织标本用含庆大霉素PBS 液反复冲洗，然后剪成1 mm3大小的组织块铺于细胞培养皿中，加入含有10%胎牛血清、200 U/mL 庆大霉素、100 U/mL 青霉素的DMEM 培养液3 mL，置于CO2孵箱中37 ℃下培养，每3 d 换液1 次，待细胞生长至80%时，加入胰蛋白酶消化并传代培养。取第4 代细胞做细胞爬片，通过二氨基联苯胺（DAB）染色观察细胞形态学结构，鉴定细胞。

1.3 细胞分组取第5 代牙周膜成纤维细胞进行实验观察，以2×103个/孔的细胞密度进行接种。根据培养液成分分组：低糖对照组（含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM培养基）、高糖组（含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基）、低糖给药组（1×10-7mmol/L 的利拉鲁肽+ 含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基）和高糖给药组（1×10-7mmol/L 的利拉鲁肽+ 含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基）。

1.4 流式细胞仪检测取1.3 中各组培养72 h 的牙周膜成纤维细胞，采用胰蛋白酶消化，PBS 漂洗2 遍，离心弃上清。加入100 μL 标记溶液重悬细胞，避光孵育15 min，离心收集细胞，PBS 洗涤1 次。加入AnnexinV 和PI 在37 ℃下避光染色15 min，然后上机检测细胞凋亡率。

1.5 Westerrn-blot 检测取1.3 中各组培养72 h 的牙周膜成纤维细胞，提取全蛋白，按照BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。上样50 mg 蛋白进行电泳分离，然后转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，再加入B 细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次，加入羊抗兔二抗，常温孵育2 h，TBST 漂洗3 次，然后在Tanon 600 图像分析系统中显色分析。

1.6 酶联免疫吸附法检测细胞炎症因子收集1.3 中各组培养24、48、72 h 时的细胞上清液，取500 μL 置于洁净EP管中。采用酶联免疫吸附法测定细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、C-反应蛋白（CRP）水平。

1.7 统计学方法采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料经S-W 法检验证实符合正态分布，以(±s)表示，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人牙周膜成纤维细胞形态与鉴定培养8～10 d 后，人牙周膜成纤维细胞脱离组织块向外延伸，细胞呈星形或长梭形，交织成为网状；随着培养时间延长，细胞以组织块为中心放射状生长，约3 周后，细胞长满培养皿内壁，密度明显增加，长梭形细胞比例升高，少数呈不规则星形。免疫组化检测可见波形蛋白染色阳性，细胞角蛋白染色阴性，说明该细胞来源于中胚层间充质细胞，与实验要求一致，见图1。

图1 相差显微镜下人牙周膜成纤维细胞形态学观察（×200）

2.2 细胞凋亡率低糖对照组、低糖给药组、高糖对照组和高糖给药组细胞凋亡率分别为（4.97±0.15） %、（3.07±0.12） %、（11.33±1.10） %、（5.87±0.49） %。与低糖对照组比，高糖对照组细胞凋亡率显著升高；且低、高糖给药组凋亡率显著低于低、高糖对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 各组PDLF 凋亡率

2.3 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况低糖对照组的Bax 蛋白相对表达量低于高糖对照组，Bcl-2 蛋白相对表达量高于高糖对照组；低、高糖给药组PDLF 中Bax 蛋白相对表达量分别低于低、高糖对照组，且低糖给药组均低于高糖给药组；Bcl-2 蛋白相对表达量分别高于低、高糖对照组，且低糖给药组均高于高糖给药组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3、表1。

表1 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况(±s)

表1 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况(±s)

注：与低糖对照组比，*P＜0.05；与低糖给药组比，#P＜0.05；与高糖对照组比，△P＜0.05。Bax：B 细胞淋巴瘤-2 基因相关X 蛋白；Bcl-2：B 细胞淋巴瘤-2 基因。

组别 Bax 蛋白相对表达量 Bcl-2 蛋白相对表达量低糖对照组 0.560±0.015 0.452±0.025低糖给药组 0.451±0.019* 0.857±0.013*高糖对照组 1.050±0.021* 0.312±0.018*高糖给药组 0.834±0.029*#△ 0.594±0.023*#△

图3 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白相对表达量表达情况比较

2.4 各组细胞培养液中炎症因子表达低糖对照组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平低于高糖对照组；低、高糖给药组细胞中炎症因子水平分别低于低、高糖对照组，且低糖给药组低于高糖给药组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 各组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比较(pg/mL，±s)

表2 各组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比较(pg/mL，±s)

注：与低糖对照组比，*P＜0.05；与低糖给药组比，#P＜0.05；与高糖对照组比，△P＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；CRP：C-反应蛋白。

组别 TNF-α IL-1β IL-6 CRP低糖对照组 179.88±14.62 63.86±12.83 97.10±21.98 53.97±5.64低糖给药组 114.33±17.01* 50.26±11.09* 83.09±8.53* 51.39±3.13*高糖对照组 387.74±66.73* 162.53±13.31* 237.73±23.46* 110.37±13.71*高糖给药组 235.96±28.14*#△ 80.58±8.25*#△ 116.74±12.49*#△ 59.39±5.75*#△

3 讨论

PDLF 是一种牙周组织中最具代表性的细胞，能够促进胶原纤维、胞外基质的合成，参与牙周组织的病变、修复及再生过程。糖尿病性牙周病变的发病机制复杂，本研究从PDLF 凋亡角度出发，分析不同环境下PDLF 的生理学活性，为糖尿病合并牙周病变的预防和治疗提供理论依据。本研究结果显示，与低糖对照组比，高糖对照组PDLF凋亡率显著升高，提示高糖环境促进细胞的凋亡，从而促进牙周疾病的发生及发展。究其原因，在高糖环境下，细胞会产生过多的细胞内活性氧，能够诱导脂质过氧化，引发细胞膜完整性丧失，线粒体膜去极化，凋亡信号通路激活，最终导致细胞凋亡。

Bcl-2 基因是目前已知的与细胞凋亡存在密切关系的重要基因，Bax 与Bcl-2 蛋白共同参与细胞凋亡的调节过程。Bcl-2 是一种原癌基因，能在不影响细胞增殖的前提下延长细胞凋亡时间，发挥抗细胞凋亡的作用。Bax 则属于促凋亡因子，通过抑制Bcl-2 活性，促进细胞的凋亡。Bcl-2/Bax 比值与细胞凋亡速率有关，其比值升高说明细胞凋亡减弱，而Bcl-2/Bax 比值下降则表示细胞凋亡增强[5]。本研究中，高糖对照组细胞培养48 h 后Bax 蛋白相对表达量高于低糖对照组，Bcl-2 蛋白相对表达量低于低糖对照组，说明高糖环境下PDLF 凋亡速度更快；而高糖给药组细胞Bax 蛋白相对表达量低于低糖对照组，Bcl-2 蛋白相对表达量高于高糖对照组，提示利拉鲁肽能调节Bcl-2/Bax的表达，抑制PDLF 凋亡，促进牙周疾病的恢复。究其原因，利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽类似物，通过与组织/细胞上胰高血糖素样肽受体结合，刺激胰岛素的分泌，降低血糖水平；另外，高糖环境下细胞活力、活性氧活性均降低，而利拉鲁肽能够降低高糖诱导的肾小管上皮细胞的凋亡，促进细胞活力，浓度越高，作用效果越明显[6]。

糖尿病与牙周疾病属于双相促进关系，且均以炎症反应为桥梁[7]。糖尿病患者机体处于亚临床炎症状态，TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 等炎症因子表达升高，导致牙周组织出现炎症反应，加快牙槽骨及周围软组织病变，限制牙周组织的修复，逐渐发展成为牙周疾病[8]；另外，牙周疾病也会介导局部炎症反应，炎症因子可通过血液循环到达远隔部位，激发全身性炎症反应，影响胰岛细胞功能，造成代谢紊乱，从而加重糖尿病病情[9]。有研究表明，糖尿病合并牙周疾病患者牙周组织中IL-1β、IL-6 等炎症介质释放显著增加[10]，因此抑制炎症反应对糖尿病及牙周疾病的治疗至关重要。本研究中，高糖对照组细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平均显著高于低糖对照组，证实高糖环境能诱导牙周细胞发生炎症反应，从而促进牙周疾患的发生及发展。另外，本研究发现，高糖给药组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平均低于高糖对照组，说明利拉鲁肽能降低糖尿病牙周微环境的炎症反应，抑制炎症因子的释放，减轻局部炎症对牙周组织的破坏。分析原因可能为，利拉鲁肽的干预能够明显抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群分化，且可减少炎症单核细胞内活性氧的生成，从而抑制炎症反应[11]。

综上，利拉鲁肽能通过降低炎症反应和调节Bcl-2/Bax的表达，抑制高糖环境下PDLF 凋亡，促进牙周健康，为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供理论依据，这可能是一种潜在的延缓糖尿病患者并发牙周疾病的防治策略。