崔丽娟,刘海霞,刘洁莹,李桂平
(广州医科大学附属惠州医院内分泌科,广东 惠州 516002)
牙周病是一种常见的口腔疾病,主要因牙菌斑内细菌及代谢产物破坏牙周支持组织,导致牙龈炎症或出血、牙齿松动的病症,严重者可引起牙齿移位或脱落。牙周膜成纤维细胞(PDLF)是牙周组织中一种重要的多能细胞,通过不断生长分化形成新的纤维和牙骨质,参与牙周组织的修复过程,对维持牙周膜完整性具有至关重要的作用[1]。有多项研究显示,高血糖会刺激PDLF 产生炎症因子,促进细胞凋亡,加剧牙周组织的破坏,进而诱发牙周疾病[2-3]。糖尿病合并牙周疾病患者,当血糖状况得到有效控制后,配合牙周局部基础治疗,牙周病变会明显好转,但在实际临床上,部分患者血糖控制不佳,牙周基础治疗无法顺利开展,因此,研究高糖环境下牙周损伤的修复具有重要意义。利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物,主要用于二甲双胍或磺脲类药物控制不佳的糖尿病患者的治疗。有报道称,利拉鲁肽能够降低血糖、减轻炎症反应、改善心血管功能[4],但其对糖尿病合并牙周疾病的影响报道较少。基于此,本研究通过体外培养人牙周膜成纤维细胞,观察利拉鲁肽对高糖环境下细胞凋亡及炎症因子的影响,探讨利拉鲁肽对糖尿病合并牙周疾病的保护机制,为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供依据,现报道如下。
1.1 主要实验材料利拉鲁肽注射液(丹麦诺和诺德公司,国药准字J20160037,规格:3 mL∶18 mg), DMEM培养基(美国Gibco 公司),胎牛血清(美国Gibco 公司),胰酶(美国Sigma 公司),碘化丙啶(PI)染液(美国BD 公司),Matrigel 胶(美国BD 公司),磷酸盐(PBS)溶液(武汉赛维尔生物科技有限公司),流式细胞仪(美国BD 公司,型号:FACSCanto),二氧化碳(CO2)培养箱(深圳市瑞沃德公司,型号:CIB-191C),台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司,型号:L 500),倒置荧光显微镜(广州微域光学仪器有限公司,型号:WSF-1600)。
1.2 原代细胞培养牙周膜组织标本来源于口腔科,选取2019 年12 月广州医科大学附属惠州医院接受正畸治疗需拔出的前磨牙的5 名志愿者。纳入标准:①年龄≥ 18岁;②牙周健康,无龋齿、牙体缺损或牙髓疾病;③无基础病史,近3 个月内未服用过激素或影响血糖的药物;④对研究知情并签署知情同意书。患牙拔出后用含有双抗的PBS 缓冲液反复冲洗,在无菌条件下锐性刮取牙根中部1/3 处牙周膜组织。将获取的牙周膜组织标本用含庆大霉素PBS 液反复冲洗,然后剪成1 mm3大小的组织块铺于细胞培养皿中,加入含有10%胎牛血清、200 U/mL 庆大霉素、100 U/mL 青霉素的DMEM 培养液3 mL,置于CO2孵箱中37 ℃下培养,每3 d 换液1 次,待细胞生长至80%时,加入胰蛋白酶消化并传代培养。取第4 代细胞做细胞爬片,通过二氨基联苯胺(DAB)染色观察细胞形态学结构,鉴定细胞。
1.3 细胞分组取第5 代牙周膜成纤维细胞进行实验观察,以2×103个/孔的细胞密度进行接种。根据培养液成分分组:低糖对照组(含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM培养基)、高糖组(含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基)、低糖给药组(1×10-7mmol/L 的利拉鲁肽+ 含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基)和高糖给药组(1×10-7mmol/L 的利拉鲁肽+ 含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基)。
1.4 流式细胞仪检测取1.3 中各组培养72 h 的牙周膜成纤维细胞,采用胰蛋白酶消化,PBS 漂洗2 遍,离心弃上清。加入100 μL 标记溶液重悬细胞,避光孵育15 min,离心收集细胞,PBS 洗涤1 次。加入AnnexinV 和PI 在37 ℃下避光染色15 min,然后上机检测细胞凋亡率。
1.5 Westerrn-blot 检测取1.3 中各组培养72 h 的牙周膜成纤维细胞,提取全蛋白,按照BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。上样50 mg 蛋白进行电泳分离,然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,再加入B 细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)抗体,4 ℃孵育过夜,TBST 漂洗3 次,加入羊抗兔二抗,常温孵育2 h,TBST 漂洗3 次,然后在Tanon 600 图像分析系统中显色分析。
1.6 酶联免疫吸附法检测细胞炎症因子收集1.3 中各组培养24、48、72 h 时的细胞上清液,取500 μL 置于洁净EP管中。采用酶联免疫吸附法测定细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、C-反应蛋白(CRP)水平。
1.7 统计学方法采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据,计量资料经S-W 法检验证实符合正态分布,以(±s)表示,多组比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 人牙周膜成纤维细胞形态与鉴定培养8~10 d 后,人牙周膜成纤维细胞脱离组织块向外延伸,细胞呈星形或长梭形,交织成为网状;随着培养时间延长,细胞以组织块为中心放射状生长,约3 周后,细胞长满培养皿内壁,密度明显增加,长梭形细胞比例升高,少数呈不规则星形。免疫组化检测可见波形蛋白染色阳性,细胞角蛋白染色阴性,说明该细胞来源于中胚层间充质细胞,与实验要求一致,见图1。
图1 相差显微镜下人牙周膜成纤维细胞形态学观察(×200)
2.2 细胞凋亡率低糖对照组、低糖给药组、高糖对照组和高糖给药组细胞凋亡率分别为(4.97±0.15) %、(3.07±0.12) %、(11.33±1.10) %、(5.87±0.49) %。与低糖对照组比,高糖对照组细胞凋亡率显著升高;且低、高糖给药组凋亡率显著低于低、高糖对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图2。
图2 各组PDLF 凋亡率
2.3 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况低糖对照组的Bax 蛋白相对表达量低于高糖对照组,Bcl-2 蛋白相对表达量高于高糖对照组;低、高糖给药组PDLF 中Bax 蛋白相对表达量分别低于低、高糖对照组,且低糖给药组均低于高糖给药组;Bcl-2 蛋白相对表达量分别高于低、高糖对照组,且低糖给药组均高于高糖给药组,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图3、表1。
表1 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况(±s)
表1 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表达情况(±s)
注:与低糖对照组比,*P<0.05;与低糖给药组比,#P<0.05;与高糖对照组比,△P<0.05。Bax:B 细胞淋巴瘤-2 基因相关X 蛋白;Bcl-2:B 细胞淋巴瘤-2 基因。
组别 Bax 蛋白相对表达量 Bcl-2 蛋白相对表达量低糖对照组 0.560±0.015 0.452±0.025低糖给药组 0.451±0.019* 0.857±0.013*高糖对照组 1.050±0.021* 0.312±0.018*高糖给药组 0.834±0.029*#△ 0.594±0.023*#△
图3 各组PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白相对表达量表达情况比较
2.4 各组细胞培养液中炎症因子表达低糖对照组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平低于高糖对照组;低、高糖给药组细胞中炎症因子水平分别低于低、高糖对照组,且低糖给药组低于高糖给药组,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。
表2 各组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比较(pg/mL,±s)
表2 各组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比较(pg/mL,±s)
注:与低糖对照组比,*P<0.05;与低糖给药组比,#P<0.05;与高糖对照组比,△P<0.05。TNF-α:肿瘤坏死因子-α;IL-1β:白细胞介素-1β;IL-6:白细胞介素-6;CRP:C-反应蛋白。
组别 TNF-α IL-1β IL-6 CRP低糖对照组 179.88±14.62 63.86±12.83 97.10±21.98 53.97±5.64低糖给药组 114.33±17.01* 50.26±11.09* 83.09±8.53* 51.39±3.13*高糖对照组 387.74±66.73* 162.53±13.31* 237.73±23.46* 110.37±13.71*高糖给药组 235.96±28.14*#△ 80.58±8.25*#△ 116.74±12.49*#△ 59.39±5.75*#△
PDLF 是一种牙周组织中最具代表性的细胞,能够促进胶原纤维、胞外基质的合成,参与牙周组织的病变、修复及再生过程。糖尿病性牙周病变的发病机制复杂,本研究从PDLF 凋亡角度出发,分析不同环境下PDLF 的生理学活性,为糖尿病合并牙周病变的预防和治疗提供理论依据。本研究结果显示,与低糖对照组比,高糖对照组PDLF凋亡率显著升高,提示高糖环境促进细胞的凋亡,从而促进牙周疾病的发生及发展。究其原因,在高糖环境下,细胞会产生过多的细胞内活性氧,能够诱导脂质过氧化,引发细胞膜完整性丧失,线粒体膜去极化,凋亡信号通路激活,最终导致细胞凋亡。
Bcl-2 基因是目前已知的与细胞凋亡存在密切关系的重要基因,Bax 与Bcl-2 蛋白共同参与细胞凋亡的调节过程。Bcl-2 是一种原癌基因,能在不影响细胞增殖的前提下延长细胞凋亡时间,发挥抗细胞凋亡的作用。Bax 则属于促凋亡因子,通过抑制Bcl-2 活性,促进细胞的凋亡。Bcl-2/Bax 比值与细胞凋亡速率有关,其比值升高说明细胞凋亡减弱,而Bcl-2/Bax 比值下降则表示细胞凋亡增强[5]。本研究中,高糖对照组细胞培养48 h 后Bax 蛋白相对表达量高于低糖对照组,Bcl-2 蛋白相对表达量低于低糖对照组,说明高糖环境下PDLF 凋亡速度更快;而高糖给药组细胞Bax 蛋白相对表达量低于低糖对照组,Bcl-2 蛋白相对表达量高于高糖对照组,提示利拉鲁肽能调节Bcl-2/Bax的表达,抑制PDLF 凋亡,促进牙周疾病的恢复。究其原因,利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽类似物,通过与组织/细胞上胰高血糖素样肽受体结合,刺激胰岛素的分泌,降低血糖水平;另外,高糖环境下细胞活力、活性氧活性均降低,而利拉鲁肽能够降低高糖诱导的肾小管上皮细胞的凋亡,促进细胞活力,浓度越高,作用效果越明显[6]。
糖尿病与牙周疾病属于双相促进关系,且均以炎症反应为桥梁[7]。糖尿病患者机体处于亚临床炎症状态,TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 等炎症因子表达升高,导致牙周组织出现炎症反应,加快牙槽骨及周围软组织病变,限制牙周组织的修复,逐渐发展成为牙周疾病[8];另外,牙周疾病也会介导局部炎症反应,炎症因子可通过血液循环到达远隔部位,激发全身性炎症反应,影响胰岛细胞功能,造成代谢紊乱,从而加重糖尿病病情[9]。有研究表明,糖尿病合并牙周疾病患者牙周组织中IL-1β、IL-6 等炎症介质释放显著增加[10],因此抑制炎症反应对糖尿病及牙周疾病的治疗至关重要。本研究中,高糖对照组细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平均显著高于低糖对照组,证实高糖环境能诱导牙周细胞发生炎症反应,从而促进牙周疾患的发生及发展。另外,本研究发现,高糖给药组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平均低于高糖对照组,说明利拉鲁肽能降低糖尿病牙周微环境的炎症反应,抑制炎症因子的释放,减轻局部炎症对牙周组织的破坏。分析原因可能为,利拉鲁肽的干预能够明显抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群分化,且可减少炎症单核细胞内活性氧的生成,从而抑制炎症反应[11]。
综上,利拉鲁肽能通过降低炎症反应和调节Bcl-2/Bax的表达,抑制高糖环境下PDLF 凋亡,促进牙周健康,为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供理论依据,这可能是一种潜在的延缓糖尿病患者并发牙周疾病的防治策略。