CRISPR/Cas9基因编辑技术在遗传性视网膜疾病中的应用

孙玺皓 综述 唐仕波 陈建苏 审校

中南大学爱尔眼科学院 爱尔眼科研究所,长沙 410015

遗传性视网膜疾病(inherited retinal diseases,IRDs)是一类因基因组异常而导致光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞结构及功能损害的疾病,常造成视力不可逆丧失[1]。目前一些IRDs的致病基因及具体突变位点已经明确,但仍缺乏有效的治疗方法。随着第3代基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein system,Cas)的出现,基因治疗和细胞替代治疗的可行性增加,为IRDs患者治疗带来了曙光。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制

2013年,Charpentier和Doudna在Nature上介绍了一种使用单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)靶向DNA进行切割的细菌酶,可实现对细菌、斑马鱼及人类细胞等多种生物基因组的编辑[2],并因此获得了2020年的诺贝尔化学奖。目前用于哺乳动物基因组编辑的是来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统[3],该系统主要包括核酸内切酶Cas9蛋白和sgRNA,通过识别、切割、修复3个步骤完成对基因组的编辑[4-5]。先由sgRNA识别目标DNA序列5'端的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motifs,PAM)来定位需要编辑的位点[6];识别靶位点后引导Cas9内切酶切割靶点位DNA双链,随后对目标区域进行非同源末端链接(nonhomologous end joining,NHEJ)修复或者在有同源修复模板的情况下进行更精准的同源定向修复(homology-directed repair,HDR)。

与既往的基因编辑技术不同,CRISPR/Cas9是通过sgRNA引导Cas9内切酶切割目标位点,故通过改变sgRNA的序列便可重新定位含有PAM区的目标位点[4]。与锌指核酸酶和转录激活物样效应核酸酶等基因组编辑工具相比,CRISPR/Cas9基因编辑系统具有设计简单、构建容易,操作周期短等优点[7];但同时其也存在同源重组效率低、易发生脱靶、可能引起p53激活,PAM区相对较窄等问题[8-10]。随着研究的不断深入,这些问题逐步得到了解决。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的优化

2.1 降低脱靶率

在进行基因组编辑时,CRISPR/Cas9可能会造成目标位点之外的基因组改变,这种现象为脱靶效应[9]。脱靶不仅发生在DNA水平,同时也存在于RNA水平[11],这不仅降低了基因编辑的精准性,也增加了其不可控的风险。为此研究者通过改变sgRNA的长度,对其进行化学修饰,使用双sgRNA识别靶位点,优化Cas9蛋白酶的结构等方式降低脱靶率[12-14]。

2.2 提升精准性

通常Cas9蛋白需在sgRNA的引导下识别目标位点,进而造成靶位点附近DNA双链断裂,同时引入同源修复模板,达到插入或修复某段DNA的目的。但该过程易造成目标位点附近碱基的随机插入与缺失,并且其效率因细胞类型和状态、所需编辑的基因组位置以及修复模板的不同而产生很大差异[15]。为此,研究者开发了单碱基编辑系统,其可以进行单个碱基的编辑,包括胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器,前者可以实现编辑窗口内单个碱基C或G到T或A的转换,而后者可以实现T或A到C或G的转化,但其应用范围较窄[16-18]。随后,Anzalone等[19]所构建的新型碱基编辑系统Prime Editing打破了碱基互换之间的限制,实现所有类别碱基的自由置换,而且可以实现多个碱基的插入与删除,进一步扩大了单碱基编辑系统的应用范围。但Prime Editing的组成构件较大,在一定程度上限制了其在体内的应用。

2.3 扩展编辑范围

PAM区的存在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的编辑范围[20]。Walton等[21]通过改变Cas9蛋白的结构,扩大了PAM区的范围,使Ⅱ型CRISPR/Cas9能够识别NYN(Y即C+T)或者NRN(R即A+G)的PAM区。可将编辑范围扩大至几乎全基因组的任何位点,进一步增加了其实用性。但PAM区的扩大会降低其特异性,增加脱靶的可能性。

2.4 提高安全性

除了提升CRISPR/Cas9的特异性与有效性之外,提高其安全性也十分重要。Harrington等[22]发现AcrIIC1可以直接结合Cas9蛋白保守的催化结构域,而AcrIIC3可以诱导Cas9蛋白二聚化,从而阻止其与靶DNA的结合,达到控制Cas9蛋白活性的目的。而Dong等[23]则发现AcrIIA4蛋白可通过在结构上模拟PAM区,阻止Cas9对双链DNA底物的识别,避免细胞和组织中不必要的基因组编辑。Nihongaki等[24]则通过对Cas9蛋白进行改造,使其活性可以受光的调控,进而控制CRISPR/Cas9在体内外表达的时间,降低其长期表达所引起的副作用。

3 CRISPR/Cas9在IRDs应用途径与方法

CRISPR/Cas9基因编辑技术在IRDs中的应用主要包括2个途径,即体外或者体内基因编辑。体外基因编辑的应用主要在细胞水平矫正人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)或者特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),然后诱导其分化为视网膜相关细胞,移植到患眼,替代原有的病变细胞;体内基因编辑主要通过相关的载体将CRISPR/Cas9基因编辑系统传递至体内,直接纠正异常组织与细胞基因组中的突变位点。

3.1 体外基因编辑

iPSCs是一类具有自体再生功能的细胞,通过诱导分化便可以衍生出不同的视网膜细胞[25]。随着体外3D视网膜类器官(retinal organoids,ROs)分化方案的不断完善,分化成熟的视网膜类器官具有一定的生理结构并且包含多种视网膜细胞[26-27],使其有可能替代传统的动物模型来进行实验研究,甚至可以将其进行移植替代原有的病变组织[28]。而由于CRISPR/Cas9可以精准地修正基因组突变,故将其和iPSCs联合应用可以更好地发挥二者的优势[29]。

Zhu等[30]将人来源的iPSCs分化的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞植入到视网膜色素变性模型小鼠的视网膜下腔,发现移植的hiPSCs-RPE细胞不仅在小鼠视网膜中发生整合与替换而且能够分泌神经保护因子,抑制小胶质细胞的活化、减少细胞凋亡,从而抑制光感受器细胞的丢失。虽然其长期的安全性和有效性有待确认,但证明了细胞替代治疗的可行性。Mandai等[31]将iPSCs来源的RPE细胞移植到新生血管性年龄相关性黄斑变性患者眼内,虽然最佳矫正视力没有改善或恶化,但证明了其可行性。随后Nishida等[32]通过3D打印模具对所产生的RPE细胞植片的形态进行了改良,产生了条状的人iPSCs来源的RPE细胞植片,该条状细胞植片在体外具有良好的扩增效率,而移植到裸鼠的视网膜下腔后,可以与宿主的RPE细胞整合,并表达正常的RPE细胞极性。而若在iPSCs诱导分化前通过CRISPR/Cas9基因编辑技术修复致病位点,再将分化成熟的细胞输送至病变部位,即可以实现自体细胞的替代治疗,在一定程度上解决供体匮乏的问题。并且由于移植物来源于患者本身,故在理论上不会引起免疫排斥反应[33]。目前已有临床试验进行了iPSCs来源的RPE细胞的移植治疗,而由于光感受器细胞培养时间长,分化效率较低,分化后的视网膜光感受器细胞结构不稳定,难以获得高纯度的细胞[34],故iPSCs来源的光感受器相关细胞的移植治疗距离实际的临床应用还有相当长的距离。

3.2 体内基因编辑

利用基因编辑技术直接在活体视网膜组织内纠正异常的基因组突变位点,从而避免iPSCs诱导分化的繁琐步骤以及外源性细胞在移植后与周围细胞整合的问题[35]。但这需要选择特异性较高的载体或者采用物理转染的方式将CRISPR/Cas9基因编辑系统传递至体内。传递载体可以分为病毒载体和非病毒载体,常见的病毒载体有慢病毒、腺病毒(adenovirus,AD)和腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)等。慢病毒及AD能够携带较大的基因片段,但其转染效率较低[36];AAV虽然只能携带不超过4.7 kb的基因片段,但在体内转染效率较高,并且具有较高的安全性和极低的免疫原性,故应用较为广泛[37]。根据对不同组织的转染偏好可以将AAV分为不同的血清型,其中AAV2、AAV5和AAV8在视网膜组织中的转染效率较高[38]。由于AAV装载量的限制,大多数情况下需要采用双AAV包装CRISPR/Cas9基因编辑系统,但双AAV的传递方案大大降低了体内基因编辑的效率[39-40]。非病毒载体的主要优势便是能够携带更大的基因片段,生物安全性高,较少引起组织的免疫反应[41],但转染效率通常较低。鉴于其较高的安全性,可以通过多次注射的方式来提高转染效率。电穿孔作为一种物理转染方法,通过高压电击瞬间提高细胞膜的通透性,可以使外源性分子传递至细胞内,并且穿过核膜进入细胞核内[42]。故通过显微注射联合电穿孔的方法可将CRISPR/Cas9基因编辑系统传递至靶细胞内。

Hung等[43]运用双AAV2作为载体将sgRNA和Cas9蛋白通过玻璃体腔注射的方式传递至表达Thy1-黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)的转基因小鼠体内,抑制YFP在视网膜内的表达,从而在不影响视网膜正常功能的情况下,对成年小鼠视网膜组织进行了基因编辑。但CRISPR/Cas9基因编辑系统在体内的长期表达可能会增加脱靶率以及引起机体的免疫应答反应[44]。故Li等[45]进一步改进了CRISPR/Cas9基因编辑系统,使其在视网膜组织中发挥作用后通过自我干扰的方式降低Cas9蛋白活性,减少持续表达所带来的副作用,从而提高CRISPR/Cas9在体内应用的安全性。Nishiguchi等[46]设计了微同源介导的末端连接,将同源重组片段长度减少至20 bp,使单个AAV便能装载CRISPR/Cas9基因编辑系统的全部元件,并将其应用于Gnat1和Pde6c基因突变所致的视杆与视锥细胞异常小鼠体内,从而恢复Gnat1基因表达,挽救视杆细胞的功能,治疗后模型鼠视网膜功能有所恢复,视敏度有所提高。该研究中的基因编辑效率约为10%,高于双AAV传递策略(<5%)[47],从而进一步提高了基因编辑的实用性。

4 CRISPR/Cas9在IRDs中的应用

由于IRDs多为单个基因突变所致,无需进行多个靶位点的修正,并且视网膜下腔处于免疫豁免的状态[48],适合应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行治疗[49]。

4.1 CRISPR/Cas9在视网膜色素变性中的应用

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一种常见的遗传性视网膜退行性疾病[50]。Buskin等[51]运用CRISPR/Cas9的HDR方式对PRPF31基因突变所致RP患者的iPSCs进行修复,并与患者来源的视网膜类器官进行对比,发现纤毛发生和细胞粘附等异常疾病表征得以改善,从而改善RPE发育。Deng等[52]采用同样的方法对RPGR基因突变所致RP患者的iPSCs进行修复,得出了与Buskin等[51]类似的结论。这些研究证明了CRISPR/Cas9在体外纠正IRDs异常表型的潜力。

在体内水平,Moreno等[53]通过双AAV2将靶向抑制NRL基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统传递至视网膜色素变性模型小鼠视网膜下腔,抑制继发性视锥细胞丢失,发现治疗后小鼠的视功能有所改善。Bakondi等[54]采用显微注射联合电穿孔的方式将Cas9和sgRNA运输至视紫红质基因S334ter位点突变所导致RP大鼠的视网膜下腔,成功敲除突变的视紫红质等位基因后,发现大鼠的光感受器凋亡得到抑制,视网膜变性程度有所缓解。这些研究均证明了CRISPR/Cas9在体内治疗RP的潜力。

4.2 CRISPR/Cas9在遗传性X连锁青少年视网膜劈裂症中的应用

遗传性X连锁青少年视网膜劈裂症(hereditary X-linked juvenile retinoschisis,XLRS)是青年男性黄斑变性的主要原因之一[55]。Huang等[56]建立了RS1基因突变(c.625C>T与c.488G>A)所导致XLRS患者来源的iPSCs细胞系,随后将iPSCs分化为ROs,在体外重现了XLRS的主要病理特征,包括视网膜劈裂、视黄醇生成缺陷和外节和纤毛形态异常。然后Huang等[56]应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对患者来源iPSCs突变位点进行修正,并分化为ROs,发现异常的疾病表型得以修复,在体外证明了CRISPR/Cas9基因编辑的有效性。并结合转录组学进一步分析发现IQCB1和OPA1等基因表达的下调也得到恢复,而这些基因的下调常导致视网膜感光细胞和其他神经细胞之间的通讯障碍,与视神经的萎缩有关[57-58]。Huang等[56]的研究为之后对XLRS的药物筛选,发现潜在治疗靶点奠定了一定的基础。而Yang等[59]将CRISPR/Cas9以玻璃体腔注射的方式传递至小鼠眼内,诱导RS1基因编码区625位点处的碱基C突变为T,以体内基因编辑的方式构建XLRS的动物疾病模型。Moore等[60]以无机纳米粒子-纳米金刚石作为载体,携带整个CRISPR/Cas9基因编辑的元件以及示踪荧光标记物,从而构建RS1 c.625C>T突变所致XLRS的点突变的小鼠疾病模型,虽然模型鼠并未出现视网膜囊肿,但表现出与XLRS相似的病理特征,如视网膜外层厚度减少,感光细胞形态出现异常等。不过该研究并没有进行基因组测序证实该位点发生突变。以上研究证明了CRISPR/Cas9基因编辑系统不仅可以在体内外构建与患者突变位点一致的细胞或动物疾病模型,而且可以在患者来源的iPSCs内纠正其突变位点,为后续在动物体内应用以及临床转化提供了研究基础。

4.3 CRISPR/Cas9在LCA10中的应用

LCA10是由CEP290基因突变所导致的常染色体隐性遗传疾病,大多数患者在婴儿期便表现出严重的视锥及视杆营养不良[61]。由于CEP290编码序列较大(约7.5 kb),超过了普通AAV的包装能力,限制了基因替代疗法在该疾病中的应用[62]。而CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效地纠正或删除特定的DNA片段,恢复正常基因的表达,使其成为LCA10潜在的治疗方法。Ruan等[63]采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在293T细胞系中引入CEP290基因突变并采用双AAV5将CRISPR/Cas9传递至野生型小鼠视网膜下腔,进而引起CEP290基因第25内含子(该内含子与人CEP290基因的内含子26同源)的缺失,分别成功构建了LCA10的细胞模型和动物模型。并且研究了具有自限能力的CRISPR/Cas9基因编辑系统,减少其在体内持续表达所带来的副作用。而Maeder等[64]应用EDIT-101靶向CEP290基因异常片断的CRISPR/Cas9基因编辑系统消除了LCA10转基因小鼠中CEP290基因突变所产生的异常剪接供体,从而恢复CEP290基因的正常表达,逆转光感受器异常。随后通过视网膜下注射的方式将AAV载体传递至非人灵长类动物恒河猴眼内,探讨了在灵长类动物体内视网膜内进行基因编辑的效率与病毒计量的关系,当病毒的浓度约1.00×1012时,其在视网膜内的基因编辑效率能够到达(27.9±20.7)%。该研究不仅证明了CRISPR/Cas9具有在非人灵长类动物视网膜内编辑基因组的能力,且能够达到治疗水平(10%的编辑效率)[64]。但有研究发现以AAV为载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统会引起轻度的炎症反应。这可能是由于AAV作为一种病毒载体具有一定的免疫原性[65]。随后经过不断的完善优化,2018年11月美国食品药品监督管理局批准了EDIT-101临床试验新药的申请,允许张锋团队开展使用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗LCA10的临床试验(NCT03872479),使LCA10成为眼科领域中首个尝试运用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行治疗的临床试验。

5 小结及展望

在体外,CRISPR/Cas9基因编辑技术可以修正IRDs患者来源的iPSCs突变位点,并将其分化为视网膜相关细胞,这对于研究疾病的发生发展机制,进行药物筛选以及后续的细胞替代治疗有着重要的现实意义;在体内,可以通过相关的载体将CRISPR/Cas9基因编辑系统传递至眼内以纠正IRDs中的基因突变,从而逆转异常的疾病表型,为研究和治疗IRDs提供一个新的方向。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在体外可以通过HDR的方式修复大部分IRDs的突变位点,但由于同源修复模板的存在,HDR方式在体内编辑的效率显著低于NHEJ方式,因此目前在体内水平主要通过NHEJ方式抑制某个基因的表达,从而纠正异常疾病表型,而单碱基编辑器的出现和不断迭代为单个碱基突变引起的IRDs提供了更加精准的治疗方式。故要使CRISPR/Cas9基因编辑系统在临床上具有更加现实的意义,还需要进一步优化其编辑效率,降低脱靶率,提升载体传递的安全性和有效性。相信随着研究的不断深入,科学技术的不断发展,这些问题也将逐步得到解决,CRISPR/Cas9基因编辑技术必将给IRDs患者带来福音。

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