线粒体遗传学机制在年龄相关性黄斑变性中的研究进展

王宇松 综述 孙晓东 审校

上海交通大学附属第一人民医院眼科 上海市眼底病重点实验室,上海 200080

线粒体是真核细胞的能量合成及代谢中心,对维持细胞完整性、调控细胞生存与凋亡发挥关键性作用。线粒体功能障碍严重影响细胞、组织的能量平衡,是导致年龄相关性疾病发生发展的重要因素[1]。目前发现线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)损伤及表观遗传修饰是衰老相关线粒体功能障碍发生的重要原因。研究显示,线粒体功能障碍及氧化应激是视网膜色素上皮损伤、感光细胞退变及视网膜炎症中的重要启动因素,对研究年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的病理机制具有重要生物学意义[2-3]。本文就线粒体遗传学调控及能量代谢异常在AMD中的研究进展进行综述。

1 线粒体遗传学

1.1 线粒体基因组特征

线粒体由需氧菌和原始真核细胞之间的共生关系进化而来,是含有多拷贝、16 569 bp环状双链mtDNA分子的半自主细胞器[4]。线粒体基因组编码13个氧化磷酸化复合体的功能性蛋白亚基、线粒体蛋白质合成所需的22种tRNA和2种rRNA,对维持氧化磷酸化呼吸链功能具有重要意义[5]。mtDNA由富含鸟嘌呤的重链(H)和富含胞嘧啶的轻链(L)组成,基因排列紧凑、存在基因重叠现象,缺乏内含子结构;双链分子不与组蛋白缠结,类核区可检测到线粒体单链DNA结合蛋白、线粒体转录因子A、mtDNA聚合酶、TWINKLE以及RNA聚合酶等蛋白分子,稳定mtDNA结构并调控mtDNA复制、转录及损伤修复等生理过程[6]。值得注意的是,线粒体基因组不结合组蛋白且无完善的核酸修复系统,在线粒体内膜呼吸链的影响下,mtDNA易发生氧化损伤及突变。

1.2 线粒体基因损伤及修复机制

线粒体电子传输链的氧利用度有限,约2%～5%的氧气无法完全还原而导致活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物的生成,其生成过量将导致mtDNA损伤[7]。mtDNA损伤包括DNA单链断裂、双链断裂、链间交联和碱基修饰及替换等,使线粒体在细胞、细胞器水平具有基因异质性。然而,多拷贝特征使线粒体基因组损伤的致病性存在阈值效应,即突变型mtDNA约达80%时细胞出现代谢障碍[6]。mtDNA突变发生后,线粒体拥有独特的融合机制和基因修复机制辅助去除突变型mtDNA拷贝,维持氧化磷酸化功能。线粒体融合机制涉及融合蛋白介导外膜融合和视神经萎缩蛋白1介导的内膜融合过程[8];而mtDNA损伤修复机制主要包括糖基化酶、AP内切酶及DNA聚合酶γ介导的碱基切除修复、hMSH2及Y-box结合蛋白1介导的错配修复和PARP1酶及MRN复合体等介导的微同源性末端接合等[9-10]。已有研究证实,随着年龄增加,体细胞内ROS蓄积、抗氧化物水平下降、DNA复制错误及修复酶表达下调等参与线粒体基因组突变的累积,是衰老相关的线粒体功能下降的重要机制;而mtDNA突变的累积促进线粒体功能下降和更多ROS的产生,形成恶性循环进而加速衰老、诱导疾病发生[11-12]。

1.3 线粒体基因组表观遗传学修饰

线粒体表观遗传学是生命科学研究的崭新领域,涉及线粒体基因的表观遗传修饰及其与核基因组之间庞大的表观修饰作用网络。线粒体表观遗传学分为4个水平:mtDNA水平修饰、类核区蛋白分子修饰、mtRNA修饰及非编码RNA的转录后调控,其中mtDNA甲基化随年龄增加的累积效应及特定基因沉默效应在慢性退行性疾病中发挥作用。mtDNA甲基化常发生于启动子区和非编码区mtDNA控制区域(displacement loop region,D-loop),通过DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)将甲基从S-腺苷蛋氨酸转移到第5位胞嘧啶碱基上(5-mC),影响mtDNA的基因表达及复制过程[13]。5-mC位点可被TET转位蛋白加氧形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC),5-hmC曾被认为是修复酶作用的中间产物,经氧化代谢及DNA修复酶切除后被正常胞嘧啶取代。近期发现5-hmC通过与甲基CpG结合蛋白2结合,亦是线粒体基因组结构和基因表达的调节点[14]。值得注意的是,mtDNMT1上调可不对称影响线粒体DNA从重链到轻链转录表达:即上调mtDNA重链的NADH脱氢酶1,而下调轻链NADH脱氢酶6,这提示甲基化调控mtDNA表达具有选择性。此外,线粒体类核区蛋白分子参与转录后mtRNA加工和核糖体组装过程,线粒体转录因子A的乙酰化、磷酸化及泛素化修饰将影响类核mtDNA的组装及功能,导致mtDNA转录异常和线粒体功能障碍[15]。

1.4 线粒体-细胞核基因组的双向调控

线粒体和细胞核基因组的双向调控在生命信息传递过程中发挥重要作用[16]。从细胞核到线粒体的信号传递称为顺向调节,核编码的转录因子、辅活化因子及表观修饰酶直接调节线粒体基因组复制、转录、表观修饰及转录后调控过程[16-17],调控线粒体的功能状态以满足细胞需求。相反,线粒体亦可逆向调节核基因组表达及表观修饰:一方面,逆行反应基因2p将线粒体功能信号传递至细胞核,激活核内转录因子;另一方面,线粒体能量代谢产生的乙酰辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸等是调控核染色体组蛋白乙酰化、DNA和组蛋白甲基化的重要辅因子,参与调控核基因表观修饰状态[18-19]。此外,应激状态下线粒体未折叠蛋白反应介导组蛋白H3K9me2修饰,广泛抑制核基因转录水平,并特异性激活线粒体未折叠蛋白反应相关基因表达,促进线粒体蛋白稳态,延长细胞寿命。这种双向调节构成了复杂的调节网络,建立细胞适应性。

2 线粒体遗传学与AMD

AMD是50岁以上人群发生不可逆性视力下降的主要原因之一,然而目前其病因仍不明确,年龄、遗传、吸烟以及高血压病史是AMD的发病危险因素。越来越多证据表明,线粒体遗传学改变是AMD相关感光细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)退行性变及玻璃膜疣(drusen)形成等病理变化的重要机制[20]。随着年龄增加,高氧环境下RPE细胞内线粒体基因组损伤累积,能量代谢效率下降,达到组织阈值后诱发RPE退变、视网膜氧化应激及炎症反应,共同导致AMD[21]。

2.1 线粒体遗传学改变与RPE功能障碍

研究显示,RPE是视网膜发生衰老相关mtDNA损伤的重点部位,且损伤程度随年龄而加重,年龄相匹配的AMD患者RPE的mtDNA异质性较非AMD者显著增高[21-22]。线粒体基因组损伤位点广泛,在D环、编码rRNA及tRNA基因等区域均检测到DNA损伤[21]。Kaarniranta等[23]发现,AMD患眼编码NADH脱氢酶的基因mt4917A>G突变和NADH-泛醌氧化还原酶基因mtA11812A>G突变的发生率均显著高于正常眼,且与RPE细胞ROS水平高度相关。此外,随年龄增长,mtDNA修复酶如PARP1、mutY同源型和核酸内切酶等水平逐步降低,加重mtDNA损伤负担[22]。干性AMD模型研究显示,RPE细胞线粒体数量及呼吸链相关亚基减少与脱色素现象、视网膜下沉积物增多等病理表现具有相关性,提示mtDNA损伤及线粒体功能障碍导致RPE代谢障碍、胞内钙稳态破坏并影响线粒体-核信号,全面影响RPE细胞功能[24]。

吞噬消化感光细胞外节和促进视循环中11-顺视黄醛再生是RPE维持视网膜功能的主要方式。衰老相关mtDNA损伤叠加在视网膜高氧浓度和高氧耗的基础上,过量ROS损伤溶酶体,导致外节的不完全消化,细胞内外脂褐素沉积进而发展为玻璃膜疣[25]。随着脂褐素的慢性光化学作用,大量氧自由基产生并进一步诱导脂质过氧化,再次加重RPE细胞损伤。

自噬是RPE清除异常线粒体、改善细胞代谢功能的保护机制之一,通过活性氧或线粒体内膜损伤激活的P13KC3通路或PINK1/Parkin通路启动自噬信号,维持线粒体稳态[26]。溶酶体功能下降(如感光细胞外节消化相关的CTSD基因或βA3/A1-crystallin基因等缺陷)及脂褐素沉积造成的自噬能力降低与AMD发病密切相关。自噬下调伴随mtDNA损伤及ROS产生增加,参与启动RPE凋亡或炎性凋亡,释放炎症因子和血管生成因子A[27]。这些变化共同导致RPE萎缩及视网膜局部炎症反应,启动一系列AMD相关病理改变。

2.2 线粒体遗传学改变与视网膜炎症反应

线粒体损伤通过多种方式促进视网膜炎症发生。衰老RPE的抗氧化系统及自噬下调背景下,线粒体基因组损伤及甲基化修饰的积累和过量ROS的产生,一方面通过NLRP3炎性小体途径激活Caspase 1/11及下游通路,Gasdermin D水解并发生N端寡聚化作用,移位至质膜而形成非选择性小孔,引起RPE细胞渗透性溶胀、破裂[28]。RPE细胞内炎症因子及炎性内容物释放至视网膜微环境,诱导局部小胶质细胞/巨噬细胞向M1型活化,启动炎症反应。另一方面,RPE损伤后启动线粒体损伤相关分子模式并释放mtDNA,激活Toll样受体9进而促进cGAS/STING通路和MAPK信号通路活化,通过核因子-κB通路直接诱导下游炎症因子释放[29]。Kerur等[30]在干性AMD相关研究中证实,患者RPE中cGAS、β干扰素、Gasdermin D和caspase-4等表达量增加,且与脂质过氧化物oxPAPC含量升高相一致,推测线粒体代谢功能受损诱导视网膜慢性炎症。因此,在自噬、抗氧化系统功能降低的背景上,衰老RPE细胞内mtDNA的积累直接参与视网膜慢性炎症反应的发生及发展,进一步加重AMD患者视网膜微环境损伤。

3 小结及展望

越来越多的证据支持AMD发病与衰老相关线粒体遗传学改变有关的假说。衰老过程中,线粒体DNA突变或甲基化沉默诱导线粒体复制、转录及能量代谢功能障碍,氧化磷酸化效率逐渐降低,ROS生成增加,损伤mtDNA并不断累积。线粒体基因组损伤在RPE退变、drusen形成和视网膜慢性炎症的不同环节发挥作用,导致感光细胞死亡和不可逆性视力受损。因此,及时调控衰老相关线粒体功能障碍有望成为抑制AMD病程进展的新思路[31]。近期研究发现,线粒体衍生肽家族成员humanin可抑制ROS生成、上调线粒体谷胱甘肽水平等,中和过量生成的ROS,保护细胞核及线粒体基因组,有效预防RPE氧化损伤[32,33]。此外,AICAR等AMPK激动剂通过PGC-1α相关基因转录有助于调控线粒体生物合成,并促进缺陷型线粒体的自噬清除,在RPE活性和视网膜炎性微环境调节中具有重要意义[34]。未来研究如能通过更有效的手段靶向性控制线粒体融合/裂变及基因组损伤修复的核心环节,在更早期保护线粒体功能,有望保护RPE形态并维持其功能,调控视网膜微环境,为AMD患者视力损伤的防治带来希望。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突