固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定尿液中四氢大麻酚和Δ9-四氢大麻酸的含量

赵志东 ,余丽宇 ,孟 娇 ,王 燕*

(1.贵州警察学院,贵阳 550005;2.中国科学院广州化学研究所,广州 510650;3.中国科学院大学,北京 100000)

近年来,大麻类毒品在我国的滥用情况越来越严重,以外籍人员、演艺人员为主要群体的吸食大麻案件屡见不鲜[1]。这类毒品中的主要精神活性成分四氢大麻酚(THC)进入机体后很快在肝脏和其他组织中代谢,Δ9-四氢大麻酸(THC-COOH)是THC的主要体内代谢物,其可在体内迅速形成葡萄糖结合物。目前THC及THC-COOH 的检测方法主要有气相色谱法[2]、气相色谱-质谱法[3-6]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[7-12]等,分析的样品包括血液、尿液、头发等。气相色谱法和气相色谱-质谱法对THC和THC-COOH 的分析往往需要先进行衍生化,前处理步骤繁琐且费时,LC-MS/MS则可对目标物直接进行分析,无需衍生化,且具有特异性强、灵敏度高的优点。因此,本工作采用离子交换固相萃取柱对尿液进行净化处理,提出了固相萃取-LC-MS/MS测定尿液中THC 和THC-COOH 含量的方法,并与传统液液提取法[13]进行对比,可为公安机关对尿液中THC和THC-COOH 的快速检测提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6470型高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪;MS3 basic型涡旋混合器;KQ500DE 型数控超声波清洗器;PUERLAB Ultra ELGA 型纯水仪;TGL-16C型离心机;MAX 混合阴离子固相萃取柱(简称MAX 柱)。

THC、THC-COOH 单标准溶液:1 g·L—1,于4 ℃避光保存。使用时,用甲醇稀释至所需质量浓度。

甲醇、乙腈、丙酮、乙酸铵、乙酸、氨水、正己烷、乙酸乙酯均为色谱纯;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,4μm);柱温40 ℃;流量0.4 mL·min—1;流动相A 为5 mmol·L—1乙酸铵溶液,B 为甲醇。梯度洗脱程序:0～2.0 min 时,A 为20%;2.0～4.5 min时,A 由20%降至5%,保持2.5 min;7.0～8.0 min时,A 由5%升至20%。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子(ESI—)模式;多反应监测(MRM)模式;氮气流量8 L·min—1,鞘气流量11 L·min—1;喷雾气压力275.79 kPa;离子源温度300℃,鞘气温度300℃;毛细管电压—3 500 V;毛细管电流3 000 n A;其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 液液提取法

取尿液样品1 mL,加入1 mol·L—1NaOH 溶液1 mL,于60 ℃水浴加热15 min,冷却后用1 mol·L—1盐酸溶液调节酸度至pH 4～5,再用体积比9∶1的正己烷-乙酸乙酯混合溶液2 mL 涡旋提取两次,以转速6 000 r·min—1离心5 min;合并上清液,于50 ℃水浴氮吹至干[13],最后用初始流动相200μL溶解残渣,所得溶液按照仪器工作条件进行测定。

1.3.2 固相萃取法

取尿液样品1 mL,加入1 mol·L—1NaOH 溶液1 mL,于60 ℃水浴加热15 min后,过活化好的MAX 柱。用1 mL 2%(体积分数)氨水溶液固定目标物,用1 mL 80%(体积分数)甲醇溶液进行淋洗,最后用1 mL含5%(体积分数)甲酸的甲醇溶液进行洗脱,收集洗脱液,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

分别使用甲醇-5 mmol·L—1乙酸铵溶液和乙腈-5 mmol·L—1乙酸铵溶液两种流动相体系对1 mg·L—1单标准溶液进行分析,考察了流动相体系对目标物响应值的影响。结果表明,两种目标物在甲醇-5 mmol·L—1乙酸铵溶液中的响应值明显高于在乙腈-5 mmol·L—1乙酸铵溶液中的,因此试验选择以甲醇-5 mmol·L—1乙酸铵溶液作为流动相体系。

分别使用 Agilent Poroshell HPH-C18(50 mm×4.6 mm,4μm)、Agilent Poroshell PFP(100 mm×3 mm,1.8μm)、Hypersil GOLD C18-50(50 mm×3 mm,1.8μm)和Hypersil GOLD C18-100(100 mm×3 mm,1.8μm)等4 种色谱柱对1 mg·L—1混合标准溶液进行分析。结果表明:两种目标物在Hypersil GOLD C18-50和Agilent Poroshell PFP色谱柱上的保留相对较弱,且经Agilent Poroshell PFP 色谱柱分离后,目标物峰形很差,响应值较低;两种目标物在Agilent Poroshell HPH-C18和Hypersil GOLD C18-100色谱柱上的保留时间接近,但THC-COOH 经Hypersil GOLD C18-100色谱柱分离后峰形较差,响应值较低。可能是因为目标物与Agilent Poroshell PFP 色谱柱的五氟苯基键合相作用力较弱,而Agilent Poroshell HPH-C18和Hypersil GOLD C18-100色谱柱的主要固定相一致,不同在于Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱中硅胶填料的表面多孔层经过了有机杂化处理,填料多孔层对酸性THC-COOH 的耐受性更强。因此,试验选择Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱作为分析柱。THC和THC-COOH 经Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱分离后的MRM 色谱图见图1。

图1 MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms

2.2 质谱条件的优化

THC 和THC-COOH 经正离子(ESI＋)和ESI—模式扫描均有响应,但在ESI—模式下的响应值明显更高,因此选择ESI—模式进行分析。在ESI—模式下将质量浓度为1 mg·L—1的单标准溶液进行一级质谱扫描,得到各目标物的母离子,然后进行碰撞反应离子扫描,得到各目标物的子离子,通过调整碎裂电压、碰撞能量,得到受干扰小、丰度较强的两对离子对。优化后的质谱参数见表1。

2.3 固相萃取柱的优化

分别用HLB 通用型固相萃取柱(简称HLB柱)、WAX 弱阳离子固相萃取柱(简称WAX 柱)和MAX 柱对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,考察了HLB 柱、WAX 柱和MAX 柱等3 种固相萃取柱对目标物回收率的影响,结果见表2。

表2 固相萃取柱对目标物回收率的影响Tab.2 Effect of solid phase extraction column on the recoveries of targets

结果表明:HLB柱对两种目标物的提取效率均偏低,THC 的回收率为70.0%左右,THC-COOH的回收率小于50.0%;WAX 柱与MAX 柱对THCCOOH 的提取效率相当,但由于WAX 柱对THC的吸附能力较弱,当淋洗液中甲醇体积分数超过20%时,目标物会被洗脱下来;若要保证目标物在WAX 柱上的回收率,则需降低淋洗液中甲醇的含量。当甲醇体积分数降低到10%时,未见THC 被洗脱,但此时THC 回收率偏低,仅为60.0%左右;在MAX 柱条件下,最高可用80%甲醇溶液进行淋洗,且两种目标物的回收率均大于80.0%。因此,试验选择MAX 柱作为净化柱。

2.4 基质效应

按照1.3节试验方法分别用液液提取法和固相萃取法对3份空白尿液进行处理,得到空白样品溶液。分别用空白样品溶液和初始流动相配制质量浓度为10.0,50.0,100.0μg·L—1的混合标准溶液,按照仪器工作条件进行测定。以空白样品溶液中目标物的峰面积与初始流动相中目标物的峰面积之比计算基质效应,结果见表3。

表3 基质效应Tab.3 Matrix effect

结果表明:液液提取法中,THC 在低浓度水平下呈现较强的基质增强效应,在中、高浓度水平下无基质效应,而THC-COOH 在低、中、高等3个浓度水平下均呈现较强的基质增强效应;固相萃取法中,两种目标物在3个浓度水平下未出现明显的基质效应。尿液成分复杂,液液提取法在提取目标物的同时也提取了较多杂质成分,这些杂质成分会对目标物的分析产生较大影响;而固相萃取法不仅对目标物进行了提取,而且还使用80%甲醇溶液进行淋洗,起到了净化的作用,从而减少了杂质成分对目标物的影响。为尽可能提高待测样品分析的准确度,除考虑基质效应外还要考虑回收率。试验发现用空白样品溶液配制基质匹配溶液建立工作曲线得到的回收率更优。因此,试验选择以基质匹配法建立工作曲线。

2.5 工作曲线、检出限和测定下限

取适量THC 和THC-COOH 单标准溶液,添加到空白样品溶液中,得到0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0μg·L—1基质匹配混合标准溶液系列,按照1.3 节固相萃取法进行测定。以目标物质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线,线性参数见表4。

表4 线性参数、检出限和测定下限Tab.4 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

分别以3,10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表4。

2.6 精密度和回收试验

按照1.3节试验方法对空白尿液样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率;分别在同一天5个不同时间段和连续5 d对加标样品进行测定,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

结果表明:固相萃取法的回收率均大于80.0%,并且日内精密度和日间精密度均优于液液提取法的。液液提取法步骤繁琐,容易引入误差,导致其精密度相对较差。

2.7 样品分析

按照试验方法对贵阳市云岩分局送检的疑似吸食大麻人员的尿液样品进行分析。结果显示,检出THC和THC-COOH,检出量分别为5.8μg·L—1和56.6μg·L—1,可认定嫌疑人有吸食大麻的行为。

本工作提出了固相萃取-LC-MS/MS测定尿液中THC 和THC-COOH 含量的方法,与传统液液提取法相比,该方法避免了有机溶剂的大量使用,节省了液液提取后氮吹的时间消耗,并且无基质效应影响,准确度高、重现性好,可作为实际案件中THC和THC-COOH 的分析方法。