QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定六堡茶中黄曲霉毒素B1 的含量

李 亚 ,梁剑锋* ,宾月景 ,奚广生 ,陈金辉 ,梁燕妮 ,蒋德莉

(1.梧州学院 食品与制药工程学院(六堡茶现代产业学院),梧州 543002;2.广西六堡茶产业科研人才小高地,梧州 543002;3.梧州市食品药品检验所,梧州 543002)

六堡茶是我国六大茶类之一,属于后发酵茶,主产区为广西、四川、云南、湖南等地。六堡茶采用的渥堆发酵、陈化工艺使其具有独特风味,但由于发酵过程是在高温高湿环境下进行,且有时候茶叶表面会有金黄色物质,所以近年来社会上广泛流传六堡茶会产生黄曲霉毒素的说法,这在一定程度上影响了人们对六堡茶的喜好。高温高湿环境中,玉米、花生等食品容易产生黄曲霉毒素[1-2],其中黄曲霉毒素B1最常见且毒性最强[3],被列为Ⅰ类致癌物[4-5]。食品中黄曲霉毒素B1的检测方法主要有酶联免疫吸附测定法(ELISA)[6-7]、薄层色谱法(TLC)[8]、高效液相色谱法(HPLC)[9-10]、超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)[11]、免疫传感法[12]等,其中ELISA、HPLC 容易出现假阳性结果,而UHPLC-MS/MS可同时分析多种真菌毒素,已经成为食品中真菌毒素检测的首选方法。国家标准GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G 族的测定》中的方法适应基质并未包含茶叶类。茶叶由于含有大量茶色素及无机杂质,常规的黄曲霉毒素B1检测方法存在干扰问题,因此开发一种适用于茶叶,特别是含有大量茶褐素的六堡茶中黄曲霉毒素B1的检测方法,对澄清社会关于六堡茶含有黄曲霉毒素的流传,保障饮茶安全尤为重要。

Qu ECh ERS是由美国化学家Steven J.Lehotay 和德国化学家Michelangelo Anastassiadas于2003年提出的农残快速样品前处理技术[13],该方法具有快速、高效、经济、准确等特点[14-18],在许多食品农残检测中被广泛应用[19-24],但在茶叶真菌毒素类检测中应用较少。因此,本工作提出了QuECh-ERS-UHPLC-MS/MS 测定六堡茶中黄曲霉毒素B1含量的方法,可为监测六堡茶中真菌毒素残留提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC1290-QQQ6490 型超高效液质联用仪;X-30型高速冷冻离心机;Multi reax 型涡旋混合器;Million Q 型超纯水器;CPA225D 型十万分之一电子天平。

黄曲霉毒素B1标准溶液:1.02 mg·L—1。

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;无水硫酸镁为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Eclipse XDB C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温5 ℃;流动相A 为0.1%(质量分数,下同)甲酸溶液,B为乙腈;流量0.3 mL·min—1;进样量2.0μL;梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)模式;多反应监测模式;定性离子对质荷比(m/z)313.0/285.2,313.0/269.1,313.0/241.1,定量离子对m/z313.0/285.2;离子驻留时间120 ms;碎裂电压139 V;碰撞能量40 eV。

1.3 试验方法

将茶叶用中药粉碎机粉碎后过80 目(0.178 mm)筛,分取2.50 g过筛的茶叶样品,置于25 mL塑料离心管中,加入2.0 mL 水润湿,再加入20 mL含1%(质量分数,下同)甲酸的乙腈溶液,振荡180 s,于4 ℃以转速4 000 r·min—1离 心10 min。取出,静置至室温,分取1.0 mL 上清液,置于预先装有250 mg无水硫酸镁、15 mg HC-C18吸附剂、80 mgN-丙基乙二胺(PSA)的2.0 mL 塑料离心管中,振荡180 s,于4 ℃以转速15 000 r·min—1离心10 min。取出,静置至室温,上清液过0.22μm 有机滤膜,续滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

茶叶主要成分为茶多酚、氨基酸、咖啡碱、儿茶素、芳香物质、色素、有机酸、可溶性糖、维生素等,其中色素、可溶性糖等杂质对目标物有较强的干扰。综合考虑目标物、杂质、提取溶剂的性质后,分别选择乙腈、含1%甲酸的乙腈溶液、甲醇、含1%甲酸的甲醇溶液、体积比3∶1的甲醇-乙腈混合溶液、体积比1∶1的甲醇-乙腈混合溶液作为提取溶剂,以目标物回收率为考核指标对空白加标样品(加标量2.88μg·kg—1)进行试验。

结果表明:以含1%甲酸的乙腈溶液为提取溶剂时,黄曲霉毒素B1回收率为88.1%,大于其他5种提取溶剂所得回收率(72.5%～81.5%)。因此,试验选择以含1%甲酸的乙腈溶液为提取溶剂,从而减少杂质对黄曲霉毒素B1的干扰。

2.2 净化剂用量的选择

样品经过含1%甲酸的乙腈溶液提取后,提取液中还有大量的无机盐、色素、可溶性糖等共提取杂质,因此需要进一步净化。试验考察了无水硫酸镁用量分别为50,100,150,200,250,300 mg,HC-C18吸附剂用量分别为5,10,15,20,25,30 mg,PSA 用量分别为50,60,70,80,90,100 mg时对空白加标样品(加标量2.88μg·kg—1)中黄曲霉毒素B1回收率的影响。

结果表明:随着3种净化剂用量的增加,黄曲霉毒素B1回收率均呈现先增大后减小的趋势;当无水硫酸镁用量为250 mg,HC-C18吸附剂用量为15 mg,PSA 用量为80 mg时,黄曲霉毒素B1回收率较大,达到87.3%。无水硫酸镁具有较强的吸水能力,在吸附提取液中水分的同时也可以吸附水溶性等强极性杂质;PSA 可与金属离子鳌合,可以有效去除茶叶中的金属离子、脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖;HC-C18吸附剂具有疏水性,对非极性杂质有吸附作用,可以去除茶叶中咖啡碱、茶碱、水溶性维生素等。当无水硫酸镁用量过多时,过量的无水硫酸镁在提取液中大量结块并局部放热,导致黄曲霉毒素B1被结块无水硫酸镁包裹而出现回收率下降的现象;当PSA 和HC-C18吸附剂用量过多时,黄曲霉毒素B1被净化剂吸附的概率增大,导致目标物回收率下降。综上分析,试验选择无水硫酸镁、HC-C18吸附剂、PSA 用量分别为250,15,80 mg。

2.3 流动相体系的选择

分别以甲醇、乙腈为有机相,0.1%甲酸溶液、水为水相进行组合试验考察。结果表明:以0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相体系时,黄曲霉毒素B1的分离效果、质谱响应信号、色谱峰峰形较佳。因此,试验选择的流动相体系为0.1%甲酸溶液-乙腈。黄曲霉毒素B1标准溶液的色谱图见图1。

图1 黄曲霉毒素B1 标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of aflatoxin B1 standard solution

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取适量的黄曲霉毒素B1标准溶液,用乙腈逐级稀释,配制成黄曲霉毒素B1质量浓度为1.44,2.88,5.76,11.52,14.40μg·L—1的标准溶液系列。按照仪器工作条件进行测定,以黄曲霉毒素B1的质量浓度为横坐标,对应的定量离子对响应值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:黄曲霉毒素B1标准曲线的线性范围为1.44～14.40μg·L—1,线性回归方程为y＝5 910x＋998.4,相关系数为0.999 9。

分别以3,10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果分别为0.03μg·kg—1和0.09μg·kg—1。

2.5 精密度和回收试验

在空白六堡茶样品中加入不同质量浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液,使黄曲霉毒素B1加标量分别为1.00,2.50,5.00,10.00μg·kg—1,分别采用本方法和GB 5009.22—2016(以黄曲霉毒素B1免疫亲和柱净化)进行测定,每个浓度水平重复测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。

结果显示:本方法的回收率为76.3%～87.3%,测定值的RSD 为2.5%～5.9%;GB 5009.22—2016的回收率为47.3%～74.0%,测定 值的RSD 为3.6%～5.1%。六堡茶在渥堆、陈化加工过程中,茶叶中的茶多酚在微生物作用下会氧化形成大量的茶褐素、茶红素等水溶性茶色素[25-26],这些茶色素大分子物质可能对免疫亲和柱吸附、分离黄曲霉毒素B1形成干扰,造成GB 5009.22—2016的回收率和精密度较差。而本方法的回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F.1和F.2的要求,说明本方法适用于六堡茶样品中黄曲霉毒素B1的安全检测分析与风险防控。

2.6 样品分析

按照试验方法对市售的50批六堡茶样品进行分析,结果均未检出黄曲霉毒素B1,在一定程度上说明六堡茶受到黄曲霉毒素B1污染的安全风险较低。相关研究已明确曲霉属真菌为黑茶发酵过程中的优势菌群[27],从食品安全角度考虑,茶叶发酵过程中曲霉属真菌可能产生黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、青霉酸等多种有害真菌毒素残留风险,但是茶叶基质成分中含有丰富的咖啡碱、茶色素、多酚、多糖等功效成分,其次生代谢物在外源真菌存在的情况下,具有可以抑制霉菌产生有害真菌毒素的能力[28]。基于以上相关研究可以推测,六堡茶这种后发酵黑茶虽然在渥堆、陈化过程中可能产生大量曲霉属真菌,但由于茶叶中含有大量的功效成分从而抑制外源微生物产生有害真菌毒素,所以检测的50批六堡茶样品中未检出黄曲霉毒素B1。

本工作通过优化提取溶剂、净化剂、色谱流动相等条件,提出了Qu ECh ERS-UHPLC-MS/MS测定六堡茶中黄曲霉毒素B1含量的方法。该方法无需使用免疫亲和柱或固相微萃取柱,具有操作简单、分析成本低等优点,并且精密度好、准确度高;同时本方法适用于高纤维茶叶类基质中黄曲霉毒素B1的检测,拓展了目前相应国家标准或行业标准适用基质的范围。