循环肿瘤DNA在妇科恶性肿瘤中的应用

尹萍 徐寒子 朱晨静

南京医科大学附属肿瘤医院，江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所 （南京 210009）

液体活检是当前精准医学时代肿瘤学与检验学交叉学科，主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、游离细胞DNA （cell-free DNA，cfDNA）和循环肿瘤DNA（circulating-tumor DNA，ctDNA）检测。其中，cfDNA 来源于死亡细胞，包括正常细胞、肿瘤细胞和克隆造血细胞等，通常是较短的DNA片段（平均长度为120 ～ 160 bp），在血浆、脑脊液及尿液中即可被检测到［1-2］。cfDNA 在人体内1 d之中变化很大，临床建议在每天的同一时间进行检测。而来源于肿瘤细胞的cfDNA 即为ctDNA。ctDNA 的检测方法分为单基因或多基因检测、已知突变的靶向检测和基于高通量测序（next generation sequencing，NGS）的全基因组检测，临床上通常采用NGS，不同的检测方法对结果有较大影响［3-4］。与组织活检相比，基于血液的生物标志物对患者的侵袭风险最小，可以获得更全面的肿瘤异质性。ctDNA 分析可以检测多种基因组畸变，包括点突变、插入/缺失、扩增（拷贝数变异）、基因融合和DNA 甲基化等［5］。目前ctDNA 主要应用于肿瘤的早期诊断、复发转移风险评估、动态监测及治疗指导等。2020 年ESMO 就开始针对不同肿瘤提出不同的NGS 使用建议［3］。妇科肿瘤和其他实体肿瘤一样都面临着无法及时早期诊断和证实复发，组织获取侵袭风险较高、动态监测灵敏度及特异度不是非常令人满意的问题，且目前常用的血液学检测手段对后续治疗无明显指导作用。基于这些原因，已有很多学者对ctDNA 做了很多研究，他们发现ctDNA 在这些方面具有一定优势。因此本文综述了ctDNA 在妇科恶性肿瘤如宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌方向临床应用进展情况，现报告如下。

1 ctDNA 在宫颈癌中的应用

2020 年中国宫颈癌发病率位中国女性癌症第六，而病死率为第七，且在部分城市呈上升趋势［6-7］。其中Ⅰ期患者占57.3%，Ⅱ期占 33.9%，Ⅲ-Ⅳ期占4.3%，其5 年无病生存期（disease-free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）随分期的增加而递减［8］。尤其复发与远处转移患者预后更差［9］。因此，早诊断早发现有助于提高患者的DFS 和OS。在中国，目前最普及的宫颈癌筛查和诊断工具是液基薄层细胞检测（thinprep cytologic test，TCT）和更敏感的 HPV-DNA 测试［10］。已知HPV 感染是宫颈癌发生的主要病因，有鉴于此，宫颈癌具有特异性ctDNA 即cfHPV DNA检测［11］。

1.1 早期诊断 GU 等［12］报道，cfHPV DNA 作为宫颈癌ctDNA 的一种特异性诊断，具有中等敏感度［0.27，95%CI： 0.24 ～ 0.30］和高度特异度（0.94，95%CI：0.92 ～ 0.96），其诊断比值比（diagnositic odds ratio，DOR）为15.25（95%CI： 5.42 ～ 42.94），ROC下面积为0.94（95%CI：0.89 ～ 0.99），体现了cfHPV DNA 较高的诊断准确率。这表明cfHPV DNA 可作为宫颈癌的无创早期诊断生物标志物。当然，如果可以检测到宫颈癌前驱病变，则更有益于早干预患者的治疗。但目前研究结果不甚理想：一方面，关于是否可以在具有前驱病变的患者的血浆中发现cfHPV DNA 存在相互矛盾的报道，且此类研究大多为2016 年之前进行，大部分样本仅使用少量血清，加之没有使用新的高灵敏度技术，结果并不令人信服［13-14］；另一方面，最近使用数字微滴PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的少数研究也并未在任何前驱病变中发现cfHPV DNA，而ddPCR在检测cfHPV DNA 方面明显优于传统PCR［15］。截止目前，cfHPV DNA 可作为宫颈癌早期诊断的生物标志物，但在检测具有前驱病变方面未能显示较为满意的结果。一方面，检测技术需要改进；另一方面，cfHPV DNA 浓度受肿瘤大小、临床分期及位置等临床特征影响，需要更多更加细致的研究进行更加全面的分析。

1.2 治疗指导 ZHANG等［16-17］对来自中国的126例宫颈癌患者的血浆样本进行了涵盖1 020 个基因的NGS 检测，结果显示 PIK3CA 是宫颈癌最常见的突变基因（约 30%），这与PIK3CA 在宫颈癌组织中的检测结果一致，提示血浆中ctDNA 的突变基因与肿瘤组织中的突变基因具有一致性。可以根据ctDNA 提示突变选择对应靶向药物。TIAN等［18］发现，对同一患者化疗前后血浆的分析显示，化疗后突变基因数量的减少与部分缓解（partial response，PR）和疾病稳定（stable disease，SD）显著相关。及时的疗效评估有助于后续治疗方案的选择。

1.3 复发转移风险评估 ctDNA 可以更早反映疾病进展［18］，如JEANNOT 等［19］报道指出，若在治疗结束后3 个月内检测到 cfHPV DNA，则平均约10 个月后患者会出现临床复发，提示ctDNA 可能是宫颈癌复发诊断的生物标志物。

1.4 预后预测 TIAN 等［18］的一项回顾性临床研究发现ctDNA 可检测到PIK3CA、BRAF、GNA11、FBXW7 和CDH1 中任意突变的复发转移宫颈癌患者，其无进展生存期（progression-free survival，PFS）和OS 明显短于未检测到的患者。这些研究也表明了ctDNA 对宫颈癌具有较高的预后预测价值。同样的，cfHPV DNA 也可对宫颈癌进行预后预测。几项研究报告结果均显示，治疗前 cfHPV DNA 的量与宫颈癌组织中HPV DNA 的量具有一致性，并且与增加的肿瘤负荷、更大的肿瘤体积、更晚期的肿瘤分期、淋巴结转移风险增加以及远处转移相关；遗憾的是未发现其与 FIGO 分期相关［14-15，19-21］。TAK 等［22］在超过一半宫颈癌患者的血浆ctDNA 中检测到HPV E7 和L1 序列。高病毒载量患者（定义为每20 µL E7 或L1 拷贝数≥ 20）在单变量分析中显示患者 5 年复发和死亡风险增加，但多变量分析未能得到相同结果。虽另有两项研究则未能证实基线cfHPV DNA 与预后之间的任何关联［19，23］，但总体来讲多数研究支持，在治疗结束时或随访期间检测到cfHPV DNA 与DFS 和OS 显著缩短以及更差的PFS 相关，且治疗后持续存在的cfHPV DNA 与不良预后之间存在相关性［19-20］。

ctDNA 检测在2022 年开始进入宫颈癌NCCN指南，即无法获取肿瘤组织的时候可以考虑使用ctDNA 来进行全基因组分析［24］。因此ctDNA 在宫颈癌中的应用愈加广泛，随着各项研究的推进，可以探索ctDNA 应用领域的更多可能性。cfHPV DNA 虽尚未进入临床，但其应用前景也是可观的。

2 ctDNA 在子宫内膜癌中的应用

不管在发达国家还是在发展中国家，子宫内膜癌都是女性生殖系统主要癌症之一，且发病率逐年上升；在中国，城市发病率高于农村，从死亡率来看，过去十几年内子宫内膜癌总体保持在一个相对平稳的状态［25］。

2.1 早期诊断 虽然子宫内膜癌预后总体良好，但有近30%的病例确诊时已是发生侵袭转移的中晚期，预后较差，早期诊断有助于改善患者预后［25］。对于子宫内膜癌的筛查，既往关于细胞学检查和经阴道超声的研究较多，然而二者均特异性较差。FENG 等［26］发现对于高风险子宫内膜癌，ctDNA 中检测到的突变基因与基线肿瘤组织中的高度一致。遗憾的是并未进一步探索ctDNA 作为早期诊断标志物的临床潜在能力。由于女性生殖系统的特殊解剖特点及子宫内膜癌的特殊解剖位置，子宫抽吸物的DNA 检测也在研究之中。有研究［27］发现子宫内膜癌患者的子宫抽吸物中都能检测到对应的基因突变，子宫抽吸物的基因检测结果可能对子宫内膜癌的早期筛查有临床意义。该作者随后发表了子宫抽吸物基因突变与子宫内膜癌肿瘤组织的一致性的病例报告［28］。不管是子宫抽吸物还是血浆之中的ctDNA 对子宫内膜癌的早期诊断都有一定的临床意义，但目前研究较少，ctDNA 指导子宫内膜癌分子分型更可能是将来研究的一个重要方向。

2.2 治疗指导 微卫星不稳定性（MSI） 最近已成为免疫治疗疗效预测的泛肿瘤生物标志物。KEYNOTE-158 研究支持了帕博利珠单抗在MSHH/dMMR 状态的子宫内膜癌患者中的应用获益，因此指南推荐了子宫内膜癌患者进行MSI 状态检测，且建议帕博丽珠单抗用于治疗MSH-H/dMMR状态的无法切除或转移性实体瘤［29-30］。近年来子宫内膜癌分子分型逐渐走入临床，NGS 检测有助于辨别其MSI 状态。在这种情况下，从ctDNA 中无创检测MSI 是一种很有前途的诊断和治疗后监测工具。SILVEIRA 等［31］发现子宫内膜癌ctDNA的检测结果与临床上常用的参考五重法之间具有高度一致性（93%），并且它们在治疗期间的动态与临床反应密切相关。

2.3 复发转移风险评估 评估复发转移风险最常用的是CA125 和HE4，但其敏感性相对较低。FENG 等［26］在67%（6/9）高危子宫内膜癌患者的基线血浆样本中检测到ctDNA，但未发现与DFS 的相关性。随后他们发现有44%（4/9）的术后患者可检测到ctDNA，其预测肿瘤复发的敏感度及特异度分别为100%和83.3%，优于CA125 和HE4；然而该项研究样本较少，仍需要更多数据的进一步支撑。

2.4 预后预测 SHINTANI 等［32］发现术前血浆中检测到的ctDNA 与较晚的FIGO 分期、病理类型、脉管癌栓浸润、无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）及OS 相关。这表明基线ctDNA 在子宫内膜癌复发风险评估及预后预测中也具有一定价值。

3 ctDNA 在卵巢癌中的应用

2020 年全球癌症统计显示，中国卵巢癌发病率位女性癌症第十，病死率位女性癌症第九［6］，严重威胁女性健康。

3.1 早期诊断 据统计，卵巢癌明确诊断时约70%的患者已经发生了转移，5 年生存率只有不到30%，而早期卵巢癌5 年生存率可达90%，因此早期诊断有助于提升卵巢癌的预后［33］。目前FDA 批准用于诊断的肿瘤标志物只有CA-125 和HE4，敏感度及特异度低，不适用于早期筛查；随访期间对CA125 的监测也未能得到对OS 有益的证明［34］。影像学检查如CT 和MRI 等应用于卵巢癌筛查亦未能显著改善其预后［35］。而组织活检虽是诊断金标准，但因其具有高侵入性（需要经手术取样），且只能提供灵敏度有限的局部采样，难以作为临床早筛手段。现有筛查缺点驱使人们不断寻找更特异和敏感的卵巢癌生物标志物。

对比上述方法，ctDNA检测具有易操、可重复性高等优势。已有大量研究证实，与良性卵巢肿瘤患者和正常卵巢人群相比，卵巢癌患者ctDNA 水平显著升高（ctDNA 水平197.176 µg/L：881.181 µg/L，P＜ 0.01）［36］。此外，与Ⅰ期和Ⅱ期（593.401 µg/L）卵巢癌相比，Ⅲ期（1 104.975 µg/L）和Ⅳ期（954.370 µg/L）卵巢癌的 ctDNA 水平也显著升高（P＜ 0.01）。且ctDNA 对卵巢癌诊断的敏感度（88.9%）及特异度（89.5%）也均高于CA125（敏感度75.0%，特异度52.6%）和HE4（敏感度80.6%，特异度68.4%）［36］。有报告指出联合检测ctDNA 的浓度和完整性更有利于卵巢癌的早期诊断［37］。也有学者对同样作为潜在血清学标志物的lncRNA 和miRNA 与ctDNA做了比较研究，他们发现ctDNA 对卵巢癌诊断的特异度和敏感度都优于lncRNA 和miRNA［38］，ctDNA 可能是更敏感和特异的卵巢癌早筛生物标志物。

单个ctDNA 的点突变检测对卵巢癌的早期诊断并没有很好的特异度及敏感度［39］。或许结合多个点突变建立诊断模型有助于提高诊断的特异度及敏感度。

DNA 甲基化的改变是肿瘤发生的早期事件之一，ctDNA 甲基化可能也是卵巢癌早期诊断的潜在标志物。研究者［40］发现血浆中的DNA 甲基化可以区分健康人群与卵巢癌人群，他们选取了11个甲基化DNA设计了一个模型，这个模型在卵巢癌诊断中具有高度特异度［96%（95%CI：89% ～ 99%）］和敏感度［79%（95%CI：69% ～ 87%）］。鉴于ctDNA的异常甲基化在卵巢癌患者和健康对照组之间的差异，我们有理由相信其可能是卵巢癌潜在有价值的诊断标志物。另有文献报道虽然早期上皮性卵巢癌患者和健康对照者的CA125 水平在单因素分析中没有显著差异，但两者ctDNA 的OPCML 甲基化水平显著不同。这进一步支持了较之传统标记物，ctDNA 特定甲基化识别早期上皮性卵巢癌更敏感和特异的观点［41］。当然，ctDNA 甲基化的诊断价值仍需要更多研究的支持。

染色体不稳定是另一可以在 ctDNA 中检测到的卵巢癌早期诊断潜在生物标志物。虽然关于染色体不稳定性的研究很少，但初步研究表明它对卵巢癌的早期诊断有一定价值，具有临床继续研究的潜力。如VANDERSTICHELE 等［42］发现，ctDNA 中染色体不稳定性的ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）为0.89 而CA125 仅为0.78，这表明卵巢癌检测中ctDNA 中染色体不稳定性检测更有意义，在HGSC（AUC 0.94）中尤为明显。

上述研究表明，在卵巢癌的早期诊断中，ctDNA 的定量、特定的基因突变、甲基化及染色体不稳定性的检测都有一定优势。鉴于目前临床ctDNA 的检测可同时包含上述内容，若将这几种方法结合，将有可能建立合适的预测模型，从而一定程度上提高卵巢癌早期诊断的特异度及敏感度。

3.2 治疗指导 对于卵巢癌的治疗监测，现有方法仍主要依赖于CA125 和CT，但敏感度有限。研究［36］表明，ctDNA 水平与肿瘤负荷显著相关。随着肿瘤负荷的增加，ctDNA 也随之增加。针对卵巢癌，患者体内ctDNA 浓度的变化可以动态反映其病变发展情况，且优于传统的CA125；SHAO等［36］研究证明了这个观点，他们发现ctDNA 达到化疗后最低点的中位时间为37（28，54） d，而CA125 为84（42，116） d。微小残留病变（minimal residual disease，MRD）概念源于白血病诱导化疗达到完全缓解后，在患者体内依然残留白血病细胞的状态，转换到实体瘤即指在根治性治疗后，传统影像或实验室方法不能发现、但通过液态活检技术可检出的体内残存恶性病灶。目前临床上通常以检测ctDNA 来评估MRD，从而指导后续治疗并评价预后。在大多数实体瘤中，MRD 阴性通常与更好的预后相关。与之相反的是，在卵巢癌中尚未有中高级别证据证实手术后MRD 阴性与更好的卵巢癌预后相关，部分原因可能是近乎全部研究将残留灶＜ 1 cm 也纳入MRD 范围［43］。

另外，分析ctDNA 的其他变化也有助于了解卵巢癌患者对治疗的反应。其中TP53 突变是HGSC 的特征性标志物，可能反映患者的病情。有研究者［44］还发现化疗后未检测到血清ctDNA 中的TP53 突变，但随着疾病进展TP53 突变会再次出现。由此可以认为，ctDNA中的TP53突变可能是卵巢癌动态监测的潜在标志物，具有重要的研究价值。TSERPELI等［45］指出在HGSC患者中，ctDNA 中SLFN11 的DNA 甲基化与晚期HGSC 中较差的PFS显著相关（P= 0.045），而SLFN11 表观遗传失活可能是卵巢癌对铂类药物耐药性的预测因子。因此，ctDNA 中基因突变及甲基化在卵巢癌治疗监测及指导中有一定作用。但是，目前缺乏大量临床数据证实。总的来说，ctDNA 分析可以评估肿瘤负荷，更好地反映治疗反应，从而制定治疗方案，为后续治疗提供参考。

3.3 复发转移风险评估 卵巢癌复发转移的评价目前仍然主要依靠CA125 和CT，但同样的其对转移病灶的检出非常有限。HOU 等［46］发现术后ctDNA 的存在与上皮性卵巢癌PFS 降低的高度相关，且在评估复发风险方面优于CA125。因此，可以认为ctDNA 在复发转移诊断中的潜力已被公认。

3.4 预后预测 关于卵巢癌的预后，据报道ctDNA的定量分析有利于对此进行评估。当ctDNA 水平超过一定范围时（22 000 GE/mL），卵巢癌患者死亡风险增加2.83 倍［47］。在晚期卵巢癌中，ctDNA中SLFN11 的甲基化则与较差PFS 显著相关［45］。而PARKINSON等［48］发现经过1周期治疗后，ctDNA 中TP53 下降＞ 60%是多变量分析中PFS 的独立预测因素（HR= 0.22，95%CI： 0.07 ～ 0.67，P= 0.008）。化疗后3 个月TP53mut ctDNA 水平相较于首次化疗后TP53mut ctDNA 水平翻倍与更差的PFS 相关（P= 0.001），而化疗后3 个月CA125 水平相较于首次化疗后CA125 水平翻倍与PFS 无明显相关（P=0.674），前者具有更好的预后预测能力［39］。

4 展望

妇科恶性肿瘤行液体活检尤其ctDNA 检测对早期诊断、异质性评估、复发转移风险评估、动态监测及后续治疗指导意义明确。目前在宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌三大肿瘤领域都有不同的研究侧重点：宫颈癌集中于cfHPV DNA 的检测，子宫内膜癌则侧重于与分子分型相结合，而卵巢癌则涉及各个方面。虽然目前只有宫颈癌诊疗指南加入了ctDNA 检测，但其在临床其他癌种的应用潜力不容小觑。目前各项临床研究仍在起步阶段，大量后续的数据支撑仍是必不可少的。过去几年内，NGS 检测技术得到飞速发展，但仍有不足：（1）NGS 检测虽然创伤小且速度快，但其检测难度及高额的花费让许多患者止步；因此探索更加经济且敏感度和特异度更高的ctDNA 检测方法同样具有临床意义。（2）目前临床上NGS 检测包含基因过多，可以进一步探索更适用于宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌的特异基因。（3）并不是所有人群都需要进行NGS 检测，需要进一步明确NGS 检测人群的选择。

【Author contributions】YIN Ping performed wrote the article.XU Hanzi and ZHU Chenjing revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.