TOP2A联合miR-21检测在宫颈癌病情及预后评估中的价值

万晶晶,姚莉,李梦琳,甘艳玲,汪晶

宫颈癌(cervical cancer)的发病机制与癌基因及微小RNA(miRNA)等表达异常有关,越来越多的研究证实癌基因与miRNA可作为宫颈癌病情及预后评估的标志物,其敏感度及特异度高于传统的肿瘤标志物及FIGO分期[1-2]。拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,TOP2A)在DNA分裂、修复重组、转录等过程中具有调节DNA拓扑结构功能,研究发现宫颈癌患者TOP2A表达显著升高且与临床病理因素相关[3]。miR-21具有调控肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为,研究发现miR-21在宫颈癌中表达显著升高[4]。目前TOP2A及miR-21在宫颈癌病情及预后评估中的临床价值尚无相关研究。因此,现分析TOP2A联合miR-21在宫颈癌病情及预后评估中的价值,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性收集2015年1月—2016年12月武汉市第三医院和武汉大学人民医院妇产科诊治的宫颈癌患者80例为CVC组,另选择同期宫颈良性疾病(包括宫颈息肉、慢性宫颈炎等)患者45例为对照组(CON组)。2组患者在年龄、病程、卡氏评分、体质量指数(BMI)、高血压、糖尿病、家族史、宫颈炎、HPV感染等方面比较差异无统计学意义(P均>0.05),具有可比性,见表1,本研究经医院医学伦理委员会审核批准(2015011),患者及家属知情同意并签署知情同意书。

表1 CVC组与CON组患者临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①经影像学、宫颈活检或手术病理组织学检查确诊;②首次诊治,既往无宫颈癌病史且未行手术、放疗、化疗及靶向药物等治疗;③卡氏评分≥70分,预计生存期≥3个月,临床资料完整。(2)排除标准:合并其他肿瘤、严重心肺血管病及子宫继发性良恶性肿瘤、精神神经疾病等。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 miR-21、TOP2A表达检测:CVC组患者取肿瘤组织及癌旁组织,CON组患者取宫颈组织。采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)法检测宫颈癌肿瘤组织、癌旁组织、宫颈组织miR-21及TOP2A表达,其中miR-21上游引物序列为5’-GCTTATCAGACTGATGTTG-3’,下游引物序列为5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;TOP2A上游引物序列为5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物序列为5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。提取各组组织总RNA纯化并定量,逆转录成cDNA后行PCR扩增(大连宝生物工程公司),反应体系为25 μl,反应条件为:45℃孵育15 min,95℃预变性1 min;55℃退火1 min,68℃延伸扩增1 min,30个循环,最后一轮72℃反应5 min。TOP2A选择GAPDH为内参,miR-21选择U6为内参,分别采用2-△△Ct计算TOP2A、miR-21相对表达量。qRT-PCR相关试剂购自大连宝生物工程公司,PCR仪器购自美国ABI公司(型号HT9700)。

1.3.2 预后随访:CVC组宫颈癌患者每3个月电话或门诊随访1次,内容包括:生存质量、肿瘤标志物、治疗状况及生存状况。随访时间至2023年4月(随访终点)。统计患者1年预后(死亡、复发、进展、继发严重并发症定义为预后不良)、总生存期及预后终点事件(死亡或存活)。

2 结 果

2.1 TOP2A及miR-21表达比较 CVC组患者肿瘤组织TOP2A及miR-21表达均显著高于癌旁组织及CON组(P<0.01)。癌旁组织与CON组TOP2A及miR-21表达差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 CON组和CVC组TOP2A及miR-21表达比较

2.2 TOP2A及miR-21表达在不同临床/病理因素中差异比较 CVC组肿瘤组织TOP2A及miR-21表达在年龄、HPV感染及病理类型方面比较差异无统计学意义(P>0.05),分化程度低分化、组织学分级G3、肌层浸润深度≥1/2、有淋巴结转移及Ⅲ+Ⅳ期患者TOP2A及miR-21表达显著高于分化程度中—高分化、组织学分级G1+G2、肌层浸润深度<1/2、无淋巴结转移及Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),见表3。

表3 宫颈癌肿瘤组织TOP2A及miR-21表达与临床病理因素的关系

2.3 预后情况 CVC组宫颈癌患者随访至终点(2023年4月)死亡52例,存活28例;疾病进展(包括复发)56例;继发直肠阴道漏12例、膀胱阴道漏9例、Ⅳ度骨髓抑制25例、Ⅳ度肝肾功能损伤21例。

2.4 TOP2A、miR-21与宫颈癌生存期关系 CVC组宫颈癌TOP2A≥1.82且miR-21≥1.36患者中位生存期(31.4±5.5)个月低于TOP2A<1.82或miR-21<1.36患者(39.6±6.2)个月(Logrank=8.645,P=0.003)。

2.5 TOP2A及miR-21预测宫颈癌1年预后不良效能分析 绘制TOP2A及miR-21预测宫颈癌1年预后不良ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,TOP2A、miR-21及二者联合预测宫颈癌1年预后不良的AUC分别为0.815、0.831、0.927,二者联合的AUC最大(Z/P=2.542/0.018、2.218/0.021),见表4、图1。

图1 TOP2A、miR-21预测宫颈癌1年预后不良ROC曲线

表4 TOP2A及miR-21预测宫颈癌1年预后不良效能比较

2.6 宫颈癌患者死亡危险因素分析 以宫颈癌患者是否死亡为因变量(赋值:是为“1”;否为“0”),以表3中P<0.05项目为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示,分化程度低分化、组织学分级G3、肌层浸润深度≥1/2、有淋巴结转移、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、TOP2A表达≥1.82、miR-21表达≥1.36为宫颈癌死亡的独立危险因素(P<0.05),见表5。

表5 宫颈癌患者死亡危险因素Logistic回归分析

3 讨 论

TOP2A识别DNA结构后形成复合物可打断并重新连接DNA双链,在DNA分裂、修复重组、转录等生理过程中具有调节DNA拓扑结构功能[5]。TOP2A在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及上皮间质转化等恶性生物学行为中具有重要作用,在宫颈癌等多种恶性肿瘤中表达上调且与其恶性程度及FIGO分期相关[3]。TOP2A自身或作为其他基因调节靶标参与宫颈癌发生、发展及转归[6-7]。研究发现TOP2A基因可通过靶向调控PI3K/AKT等信号通路调控宫颈癌细胞迁移及侵袭[8]。生物信息学分析发现宫颈癌组织TOP2A基因mRNA及蛋白表达均显著上调,与宫颈癌恶性程度及FIGO分期相关,TOP2A基因高表达宫颈癌患者预后及生存期差于低表达患者[9-10]。基于目前的研究进展推测TOP2A在宫颈癌病情及预后评估中可能具有重要价值,可作为宫颈癌病情及预后评估的标志物。本研究中,宫颈癌患者肿瘤组织TOP2A表达显著高于癌旁组织及宫颈良性疾病患者,证实TOP2A基因与宫颈癌发病机制存在关联。本研究进一步研究发现TOP2A表达与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关,表明TOP2A可作为宫颈癌病情及预后评估的标志物。

miRNA为内源性非编码单链RNA,主要是通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译来调控转录后基因表达,在细胞增殖、凋亡、上皮间质转化等多种生物学过程中发挥重要作用[11-14]。研究发现,miRNA表达异常与宫颈癌发生与发展有关,宫颈癌患者可检测到miRNA表达异常,在宫颈癌病情及预后评估、临床诊疗中具有重要作用[15-16]。miR-21可通过多种机制调控细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为,在多种恶性肿瘤发病机制、病情及预后评估中具有重要价值[17-20]。研究发现miR-21与宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭相关[21]。miR-21与局部进展期宫颈癌放疗不敏感相关[22]。越来越多的研究发现miR-21在宫颈癌患者中表达显著升高,且与病情及预后相关[23-24]。本研究中,宫颈癌患者肿瘤组织miR-21表达显著高于癌旁组织及宫颈良性疾病患者,表明miR-21与宫颈癌发病机制相关。进一步研究发现miR-21表达与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期、生存期及死亡风险密切相关,表明miR-21在宫颈癌病情及预后评估中具有重要价值。

目前宫颈癌病情及预后评估常用的方法包括肿瘤标志物、影像学检查及FIGO分期等,前者存在敏感度及特异度低等缺点(目前报道的敏感度及特异度均在0.6～0.8),后者存在受检查者主观因素影响大、可重复性及普适性差等缺点,尤其不适用于无法取得明确病理分期患者,故探讨新型高效安全的基因水平标志物更具有临床价值[25-26]。随着对宫颈癌发病机制的深入研究及基因检测水平的提高,基因水平的标志物可能在宫颈癌病情及预后评估中具有更高的敏感度及特异度,具有检测快捷方便等优点[27-28]。本研究中TOP2A、miR-21预测宫颈癌1年预后不良的AUC、敏感度及特异度高于目前报道的分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移及FIGO分期,尤其是TOP2A联合miR-21检测时AUC、敏感度及特异度显著升高,表明TOP2A联合miR-21检测在宫颈癌病情及预后评估中的临床价值高于传统的检测指标。

综上所述,宫颈癌患者TOP2A及miR-21表达显著升高,与分化程度、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、FIGO分期相关,可作为宫颈癌病情及预后评估的标志物。TOP2A联合miR-21检测可显著提高预测宫颈癌预后不良的敏感度及特异度。值得注意的是,本研究中TOP2A及miR-21依赖于病理标本的检测仍存在普适性差等缺点,不依赖于病理标本的血清学TOP2A及miR-21可能更具有临床价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

万晶晶、甘艳玲:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;姚莉:进行统计学分析;李梦琳:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;汪晶:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写