牧草种子活力评价方法研究进展

陶奇波，郄西虎，张倩，高宇轩，张亚锜，张瑞真，陈晓菲，牛天秀，孙小同，聂宇婷，刘雅如，胡珈齐，钟尚志，孙娟*

（1. 黄河三角洲草地资源与生态国家林业和草原局重点实验室，青岛市滩涂盐碱地特色植物种质创制与利用重点实验室，农业农村部人工草地生物灾害监测与绿色防控重点实验室，青岛农业大学草业学院，山东 青岛 266109；2. 青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

种子在植物学上指由胚珠发育而来的繁殖器官，是植物遗传信息和世代繁殖的载体［1］。在草牧业生产中，种子是最基本的生产资料，起到“芯片”的关键作用［2-3］。高质量的牧草种子是人工草地建植、退化天然草地改良、提升我国草牧业发展水平的物质基础，也是城市绿地建设及生态环境脆弱地区开展生态修复工程的重要基础材料［4-5］。相较于农作物，牧草种子往往体积细小、重量较轻，且常被种植于一些寒旱地区以及水肥条件较差的边际土地，因此在草牧业生产及生态修复实践中，须选用高质量牧草种子以确保在复杂环境下的成功出苗和建植［6］。另外随着草业机械化水平的快速提升和牧草/农作物间作、套作等创新栽培模式的广泛应用，对牧草种子质量的要求也与日俱增［7-9］。

种子活力（seed vigor）是描述种子质量的综合性指标，是指种子在萌发和幼苗生长期间活性水平和特性的综合表现，反映了种子在广泛田间条件下迅速整齐出苗和长成茁壮幼苗的潜力［10］。高活力牧草种子在生产实践中具有如下几方面的优势：1）良好的田间发芽、出苗能力，建植整齐迅速且幼苗茁壮；2）更强的抗逆性，可在田间更加广泛的逆境条件下保障出苗和建植；3）耐储性更好，种子寿命和商品种子的储藏年限更长［11-12］。因此，开展精确而快速的牧草种子活力评价，有助于在生产上选择高活力种子用于播种，并预测种子在田间条件下的出苗建植表现和幼苗生长发育的活性水平，是实现生态草牧业高质量发展的基础和关键环节［13］。此外，高效的牧草种子活力评价方法也可为高活力牧草种质资源的挖掘、筛选、评价及新品种遗传选育奠定基础［14］。

鉴于开展种子活力评价的重要意义，牧草种子活力评价相关研究一直是草业和种业科技工作者重点关注的领域。国际种子检验协会（International Seed Testing Association，ISTA）已推荐了电导率法、人工加速老化法、控制劣变法、胚根突出法和四唑法等5 种活力评价方法［15］，然而目前绝大部分标准化的方法均是针对农作物和园艺作物，而适用于牧草种子的标准化方法较少。不同牧草种子，往往适用的活力评价方法和条件存在较大差异，同一物种的不同品种间也可能存在差异，这种差异主要受到不同物种和品种的遗传背景、种子结构、化学组分和品种特性等多方面因素影响［6，16-17］。本研究在系统查阅国内外相关文献的基础上，从种子活力的概念及其发展、牧草种子活力评价方法的研究进展等方面进行综述，重点介绍活力评价方法的原理及其在牧草种子上的研究现状，并提出未来的研究展望，以期为开展牧草种子劣变与活力基础研究提供重要理论基础，为活力评价的实践提供科学依据与指导，推动我国生态草牧业高质量发展。

1 种子活力的概念及其发展

一直以来，标准发芽试验的结果是检验种子质量的重要标准。然而有研究发现，即使是拥有市场上可以接受的高发芽率的种批，在更广泛的田间条件下出苗和形成正常幼苗的能力方面可能依然存在较大不同，其原因在于实验室最适的发芽条件掩盖了种子的真实质量水平［18］。因此人们试图寻找可以更加精准反映种子质量的综合性指标。早在1876 年，种子学创始人德国Friedrich Nobbe 教授就观察到种子个体间在萌发和幼苗生长能力上的差异，并将这种差异的原因归结为“Triebcraft”，意为“驱动力”［19］。“驱动力”的概念经过反复讨论和发展，以“活力”一词而被广泛接受，以至于ISTA 在1953 年成立了活力委员会［20］。1957 年，Isely［21］首次定义了种子活力，即在不良的田间条件下成苗的一切特性的总和。Perry［22］将种子活力定义为决定种子或种批在萌发和出苗阶段内在活性以及表现性能潜在水平的所有特性的总和，该定义已被 ISTA 采用。北美官方种子分析家协会（Association of Official Seed Analysts，AOSA）于1983 年将种子活力定义为在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗以及幼苗正常生长的潜力［23］。我国著名种子生理学家郑光华先生也于 1980 年提出了种子活力的定义：种子的健壮度，包括迅速整齐萌发的发芽潜力、生长潜势和生产潜力［24］。2006 年，颜启传教授更加详细地描述了种子活力，认为种子活力是指充分成熟、充实饱满、健康无病虫、完整无损伤、耐贮性好的非休眠种子，在广泛环境条件下，表现出抗逆性强、发芽、出苗快速整齐、茁壮生长、正常发育等特点，能长成健壮整齐的、正常的幼苗，具有实现高产量和品质的潜在能力［25］。

综合上述概念可知，除了常规的种子发芽特性外，种子活力更关注在更加广泛而不可预知的田间条件下出苗和长成茁壮植株的能力，这也更加贴近于牧草种子本身的种用价值，对于牧草丰产和草地生态修复具有重大意义。另外种子活力也十分强调种子本身的抗逆性和耐储藏等特性，使其成为一项描述牧草种子质量的全面的性能指标。这也意味着种子活力无法同种子发芽率一样定量地表示，而是需要采取适宜的活力检测方法间接地反映。

2 基于牧草种子物理性状的测定方法

牧草种子形态特征多样，基于牧草种子物理性状如色泽和大小等的活力测定方法，具有经济性好、操作简便和迅速等优势，在牧草种子活力评价中具有较为广泛的应用。

2.1 牧草种子色泽

基于种子色泽开展的牧草种子活力评价，主要集中在豆科牧草。种子色泽的差异往往是因为种子成熟度的不同，而种子成熟度又是影响种子活力的重要因素［26］。Delouche［27］认为依据种子颜色是评价绛车轴草（Trifolium incarnatum）种子活力的最有效方法。有研究表明，亮橄榄绿色的紫花苜蓿（Medicago sativa）种子活力要显著高于干褐色种子［28］。不同颜色的紫云英（Astragalus sinicus）种子活力具有显著差异，从大到小依次为黄绿色种子、浅绿色种子、原样种子、红棕色种子［29］。张震东等［30］通过模糊隶属函数法研究发现不同颜色黄花草木樨（Melilotus officinalis）种子活力由高到低依次是黄色种子、红色种子、混样种子、绿色种子。多叶羽扇豆（Lupinus polyphylla）绿色种子的活力要显著高于黄色和褐色种子［31］。在黄花苜蓿（Medicago falcata）上的研究表明，黄褐色种子的活力要显著高于褐色与暗绿色种子，这和种子的成熟程度息息相关［32］。也有一些研究表明，应用种子颜色评判牧草种子活力应该综合考虑多因素的影响，如Stanisavljević 等［33］认为灰白色箭筈豌豆（Vicia sativa）种子适合在储藏9 或21 个月后进行播种，而储藏33 个月以后，黑色种子的活力更高。非豆科牧草，如禾本科的羊草（Leymus chinensis），种子活力随种子颜色的加深而显著降低，以浅黄色羊草种子活力最高［34］。然而，种子颜色在评价牧草种子活力方面也有一定局限性，如颜色是一个感官指标，受到主观因素影响较大，且不同牧草种子颜色不同，缺乏标准的颜色划分体系，在不同研究中结果变异也较大，导致在实践中应用受到限制。例如，采用种子颜色评价红三叶（Trifolium pratense）种子活力，存在数套推荐的颜色划分体系，吕鹏辉等［35］认为种子活力由高到低依次为黄色、褐色、混色、黄褐色，亦有研究将红三叶种子分为黄色、紫色、褐色和混色4 类，其中黄色种子活力最高，褐色种子活力最低，紫色和混色种子活力相近［36］。而Velijević 等［37］仅将红三叶种子按照颜色分为亮色、深色以及混色3 类，认为亮色种子活力显著高于其他种子。可见不同研究中对种子颜色的认定差异较大，且研究结果并不一致，如此对实践的指导意义则不大。

2.2 牧草种子大小和重量

牧草种子大小和重量与种子活力的关系已有广泛研究，多数报道集中在20 世纪（表1）。在羊草［38］、多年生黑麦草（Lolium perenne）［39］、箭筈豌豆［33］、紫花苜蓿［40］以及许多牧草种子上的研究均表明，在遗传背景相同的前提下，大粒种子由于成熟度高、营养物质贮藏量大，可以为种子萌发、出苗以及幼苗早期生长阶段提供更多的养分与能量，因而种子活力较小粒种子高。然而，也有研究表明牧草种子大小和重量与种子活力没有必然联系，如Cooper 等［41］指出紫花苜蓿种子大小对种子活力和出苗率无显著影响。也有研究表明百脉根（Lotus corniculatus）种批间种子大小与幼苗生长状况无显著相关性，这可能是因为种子储藏年限与条件的不同所致［42］。由此可见，依据牧草种子大小与重量进行种子活力评价，有一定不确定性和不稳定性，因而近20 年来相关研究逐渐减少。如要运用种子大小与重量开展牧草种子活力评价，需要保证种子遗传背景、储藏年限和条件的一致性和稳定性，另外针对种子大小和重量的分级也需进一步细化。

表1 种子大小和重量应用于牧草种子活力评价的物种相关信息Table 1 Research carried out to apply seed size and mass to estimate seed vigor of forage species

2.3 牧草种子吸水速率

种子吸水速率是一种主要用于豆科牧草种子活力测定的物理性状，也称快速吸涨法（quick swell）［12］。其原理在于活力低的豆科牧草种子种皮破损程度高、吸水快，从而导致子叶受损和种子内含物渗漏［81］。在小冠花（Coronilla varia）上的研究表明，种子吸水和膨胀的时间越长，则其产生的腐烂和不正常幼苗比例越低［82］。在鹰嘴紫云英［83］、绛车轴草［84］、白三叶［85］和红三叶［85］等豆科牧草上亦有类似结果。然而，在柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）和细枝岩黄耆（Hedysarum scoparium）上的研究表明，种子膨胀吸水率与种子活力无关，这可能归结于这些豆科牧草的种子硬实以及果荚难与种子分离等原因［86］。

3 基于牧草种子萌发特征的测定方法

3.1 种子萌发相关指标

由于标准发芽率（standard germination percentage）是在实验室的最适萌发条件下测得的，无法全面反映种子在更广泛条件下的出苗及幼苗生长表现，因此绝大部分情况下无法精确表征种子活力水平，前人在紫花苜蓿［87］、燕麦［88］和垂穗披碱草（Elymus nutans）［88］等牧草种子上的研究均验证了上述结论。而基于其他种子萌发特征，包括平均发芽时间（mean germination time，MGT）、基于胚根刚突破种皮的平均发芽时间（mean just germination time，MJGT）、发芽指数（germination index，GI）和发芽势（germination energy，GE）等指标，则被广泛认为可以准确反映牧草种子活力并预测田间出苗（表2）。与最终发芽率不同，上述萌发特征指标更加强调对牧草种子萌发过程，尤其是萌发速度的描述，而多数研究认为萌发速度与种子活力呈正相关。MGT 或MJGT 也可认为是一批种子从吸水到萌发（胚根突破种皮）的平均滞缓期（lag period）长度，基于种子老化/修复假说，高活力种子在萌发过程中损伤修复时间更短，因此萌发的滞缓期更短［89-90］。滞缓期长度最初用于玉米（Zea mays）种子活力的测定［91］，现已广泛应用于多花黑麦草［92］、紫云英［93］以及箭筈豌豆［94］等牧草种子的活力测定。

表2 种子萌发相关指标用于牧草种子活力评价的物种、萌发温度以及萌发标准等信息Table 2 Information on application of seed germination characteristics on forage seed vigor estimation： Species，germination temperature and criteria of germination

采用萌发相关性状测定种子活力，应注意遵照ISTA 规程或国家标准，使种子萌发的条件标准化，以利于测定结果的准确性和可重复性。同时，如果测定牧草种子的萌发对光照无严格需求，应在黑暗条件下开展试验，以便于消除不同设备间光照条件的差异性。此外，目前的种子活力测定，常用的种子萌发标准有3 种，即正常苗、胚根≥2 mm、胚根刚突破种皮（肉眼可见），其中正常苗是标准发芽试验的萌发计数标准（表2）。研究表明，以不同标准作为萌发计数的依据，牧草种子活力的测定结果也有所不同，如以胚根肉眼可见为标准计算的紫花苜蓿MJGT 与田间出苗率的相关性要高于以胚根≥2 mm 为标准计算的MGT［95］。Mao 等［96］也发现燕麦的MJGT 与出苗率的相关性较MGT 更高。因此在基于牧草种子萌发性状开展种子活力测定中，尤其需要注意萌发计数标准的选择，在条件允许时，可以采用多标准统计萌发指标，并比较不同标准下的评价效果。

3.2 胚根突出法

基于萌发性状的牧草种子活力评价需要统计连续时间间隔内的种子萌发数，在实践上可能耗费时间过多。标准发芽率虽然无法精确反映种子活力，但是种子吸水萌发早期的胚根突出或者萌发率，则对种子活力较为敏感［111］。胚根突出法（radicle emergence，RE）是ISTA 推荐的活力测定方法，最早也是应用于玉米种子活力评价［112］。同时这种方法也在油菜（Brassica napus）和莱菔（Raphanus sativus）中实现了标准化，收录入ISTA 种子检验国际规程［113］。

应用 RE 评价牧草种子活力需要从与田间出苗率的相关性高低和花费时间长短等方面入手，寻找适宜的胚根突出率统计时间点。该方法相比于其他萌发性状，往往精确度更高、也更加省时，一般统计的时间节点为20～72 h，而对于一些萌发较慢的物种或萌发温度较低的情况下，统计时间点可能会更晚（表3）。RE 的另一大优势在于可以作为标准发芽试验的一部分，可在一次试验中完成2 种活力测定。在牧草上绝大部分研究选择胚根≥2 mm 作为胚根突出的标准（表3）。

表3 应用胚根突出法评价牧草种子活力的试验温度、胚根突出标准以及统计时间点等试验条件相关信息Table 3 Research establishing conditions to apply the radicle emergence test to estimate seed vigor of forage species：Temperature，criteria of radicle emergence，and timing for radicle emergence count

高活力种子在胚根突出种皮前所需要的损伤修复，如生物膜、DNA 修复时间更短，即从开始吸水到胚根突出的时间（滞缓期）更短，从而在特定时间点的胚根突出率更高［114-115］。在众多牧草及饲用植物上的研究均已筛选了针对特定物种的适宜胚根突出统计时间点，同时通过计算回归分析决定系数（R2），发现该时间点的胚根突出率和田间出苗率有紧密且显著的正相关关系（表3），为牧草种子的活力研究和生产实践提供了重要理论基础与技术支持。此外随着自动化技术的进步，将RE 试验和自动拍照技术相结合，可实现更加高通量的牧草种子活力评价。

4 基于牧草幼苗生长的测定方法

由于种子活力的概念包含幼苗生长潜势及茁壮生长等内涵，因此基于幼苗生长状况同样可开展牧草种子活力的测定。植物幼苗的鲜重、干重、幼苗长、胚根长、胚芽长等均是常用的指标［123］。在相同条件下，产生的幼苗结构完整、长势好，则种子活力高；若产生的幼苗长势弱，或不正常苗率高，则种子活力差［124］。Pereira 等［125］的研究表明大黍（Panicum maximum）根长和苗长均与田间出苗率显著正相关，可以准确反映种子活力水平。也有研究表明萌发第3 天的幼苗长度是评价百脉根种子活力的精确快速方法［126］。但Wang 等［127］的研究认为胚根长度与紫花苜蓿、光叶紫花苕、苏丹草和老芒麦等牧草种子活力无显著相关性。

此外，通过幼苗长势计算出的活力指数（vigor index），既涵盖了发芽速度相关信息，又反映了植物幼苗长势，也在牧草种子的活力测定方面有着广泛的应用（表2）。如Venuste 等［121］研究表明中华羊茅（Festuca sinensis）种子活力指数和2 年的田间出苗率显著正相关，因此可以精确评价种子活力。

5 基于逆境试验的牧草种子活力测定

依据不同活力水平的牧草种子对各种不良环境的抵抗性，可检测种子活力的高低。众多研究表明这种检测方法具有较强可靠性和可重复性。基于逆境试验的活力检测主要包括人工加速老化法以及抗逆萌发法等。

5.1 人工加速老化法

人工加速老化法（accelerated ageing，AA）是在人工控制的高温（ISTA 推荐41～45 ℃）和高湿（100%相对湿度）条件下加速种子老化，从而可以在较短时间内模拟出种子在自然条件下的老化过程，体现出牧草种子活力的差异。高活力牧草种子对人工加速老化的抵抗性更强，从而在处理后依然可以表现出更高的发芽率和幼苗生长表现。人工加速老化可为评价牧草种子的田间出苗性能和耐储藏性提供重要参考信息［128］。此外人工加速老化也是牧草种子活力基础研究的常用手段［129］。此法简便易行，且不需要昂贵精密的仪器和试剂，因此局限性小、应用范围广［123］。应用AA 评价牧草种子活力，多年来已有了广泛研究，不同牧草种子人工加速老化的适宜温度和时间通常不同，因此需要对老化条件进行优化（表4）。同种牧草可能在不同研究中，筛选的适宜老化温度和时间也不同，这可能是因为所用品种、储藏年限以及老化后测定指标的不同导致的，在研究及生产实践中需要根据实际情况选择适宜的方法开展人工加速老化处理。

表4 人工加速老化法用于牧草种子活力评价的物种、适宜老化温度和时间信息Table 4 Information on application of accelerated ageing test on forage seed vigor estimation： Species，optimum ageing temperature and time

5.2 饱和盐溶液加速老化法

在AA 的基础上，Jianhua 等［178］提出了饱和盐溶液加速老化法（saturated salt accelerated ageing，SSAA），该方法在操作上和AA 的区别在于用饱和盐溶液（一般是NaCl）替代水。由于饱和盐溶液对水分的固定作用更强，降低了水分蒸发，因此与AA 相比，SSAA 的种子老化环境相对湿度较低，一般是75%左右，从而使牧草种子在老化过程中吸水速率和劣变程度降低，使老化过程更为柔和，结果更加准确和稳定［131］。饱和盐溶液加速老化还可抑制牧草种子老化过程中微生物的繁殖和生长［20］。由于牧草种子相对于传统农作物往往更加细小，在老化过程中需要注重调控种子含水量增加的速率，防止吸水过快，因此SSAA 在牧草种子活力研究和检测中有重要的应用潜力［179］，目前在柳枝稷［131］、狗牙根［180］、籽粒苋（Amaranthus cruentus）［181］等牧草种子中都有所报道（表5）。

表5 饱和盐溶液加速老化法用于牧草种子活力评价的物种、适宜老化温度和时间信息Table 5 Information on application of saturated salt accelerated ageing test on forage seed vigor estimation： Species，optimum ageing temperature and time

5.3 控制劣变法

控制劣变法（controlled deterioration，CD）又称催腐劣变，这种人工老化方法最早用于小粒蔬菜种子活力测定［194］，现已经广泛应用于牧草和饲料作物的种子活力测定与评价（表6）。该方法一般是将调整至特定含水量的种子密封入铝箔袋，置于高温条件（一般是40 或45 ℃）进行老化。CD 原理和人工加速老化、饱和盐溶液加速老化类似，均是通过高温高湿条件加速牧草种子老化，并测定老化后的萌发率等指标，从而探究种子活力。但是CD需要更加严格地控制被老化牧草种子的含水量（表6），更加适合小粒牧草种子活力的测定［12］。有研究表明CD 可以准确检测豆科牧草紫花苜蓿和光叶紫花苕，禾本科牧草老芒麦和苏丹草的种子活力并准确预测其田间出苗表现［127］。然而在多花黑麦草上的研究表明CD 评价种子活力的结果并不稳定［195-196］。这可能与劣变处理后所测定的指标有关，Wang 等［197］研究发现在红三叶种子活力测定中，控制劣变处理后统计正常苗率的检测精度要高于统计胚根萌发率。未来有必要扩大研究牧草物种范围以及探索温度、种子含水量等相关影响因素，使CD 评价牧草种子活力更加精准与可靠。

表6 控制劣变法用于牧草种子活力评价的物种、种子含水量、适宜劣变温度和时间信息Table 6 Information on application of controlled deterioration test on forage seed vigor estimation： Species，seed moisture content，optimum deterioration temperature and time

5.4 抗逆萌发法

基于不同活力的牧草种子抵御干旱、盐碱、冷冻、低温、压力以及复合等逆境胁迫方面的显著差异，可利用抗逆萌发法来评价牧草种子活力。如十分经典的希尔特纳试验（砖砾）就是模拟种子在萌发出苗期间遭受的土壤黏性、板结等机械压力，高活力牧草种子顶出砖砾能力强，而低活力种子反之，有研究表明希尔特纳试验是紫花苜蓿和扭花车轴草（Trifolium resupinatum）的种子活力适宜测定方法［201］。Chen 等［202］利用10 个紫花苜蓿种批在不同渗透势（PEG-6000）下的萌发表现，建立了水势模型，发现水势中位值［Ψb（50）］与田间出苗率显著负相关，可以用于评价种子活力，而水势时间值（θH）和水势中位值的标准差（σφb）则和田间出苗率无显著相关性。干旱低温（-0.2 MPa+15 ℃）复合胁迫下的冷地早熟禾［119］和中华羊茅［121］种子发芽率和田间出苗率显著正相关，可以用于评价其种子活力。低温胁迫下的披碱草（20 ℃）［119］和百脉根（5 ℃）［118］种子萌发率同样和田间出苗率显著正相关。干旱胁迫下红三叶（-0.15 MPa）和猫尾草（-0.6 MPa）种子发芽率是评价种子活力的适宜指标［105］。

6 基于生理生化指标的牧草种子活力测定

6.1 电导率法

电导率法（electrical conductivity，EC）是目前研究与应用最为广泛的种子活力评价方法之一，该方法具有测定精确、操作简便、成本低、时效性强和适用范围广等优势［25］。其原理在于测定种子吸胀初期的细胞内氨基酸、有机酸以及可溶性糖等电解质渗漏程度，以评估细胞膜重建和损伤修复能力，高活力牧草种子往往能够更快进行膜重建和损伤修复，以最大程度降低电解质渗漏量，从而使种子浸出液电导率降低［127］。因此，牧草种子浸出液电导率和种子活力一般呈负相关。应用EC 测定牧草种子活力需要优化浸种温度、浸种时间、每重复用种数量、所有容器体积和每重复加水体积等参数，使测定结果更加精确和可重复（表7）。目前此法已收录入ISTA 种子检验国际规程，并在鹰嘴豆、大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）等植物的活力评价中实现了标准化［113］。

表7 电导率法用于牧草种子活力评价的物种、浸种温度、浸种时间、每重复用种数量以及每重复用水体积等信息Table 7 Information on application of electrical conductivity test on forage seed vigor estimation： Species，seed soaking temperature，seed soaking time，number of seed per replication，and volume of water per replication

有研究表明，EC 尤为适宜豆科牧草种子活力评价［203］，但是针对禾本科牧草的活力测定，结果并不稳定和一致，如燕麦种子浸出液电导率可以准确反映种子活力，但多年生黑麦草、垂穗披碱草和羊草的种子浸出液电导率则和田间出苗率不相关，原因在于这些禾本科牧草种子种皮存在半透层（semipermeable layer），阻碍了种子内含物的渗出，当刺破种皮后再测定电导率，则电导率和田间出苗率呈显著负相关，即可以用于开展活力评价［204］。因此运用电导率测定禾本科牧草种子活力，必须注意该物种有无半透层，如存在则需要在浸种前刺破种皮或横切种子，以利于种子内含物渗漏。虽然已有众多研究涉及EC 测定牧草种子活力（表7），但是目前尚无物种经过ISTA的标准化。

6.2 DNA 复制速率

近年来，随着细胞生物学技术的进步，采用流式细胞术测定种子吸水早期的 DNA 复制速率，用于评价牧草种子活力已有报道。Cheah 等［236］认为，种子萌发过程中DNA 的复制，即4C 型细胞核的增加，是在DNA 损伤修复完成后才开始的，由于高活力牧草种子所需的损伤修复时间更短，因此在种子吸水早期的4C 核比例应更高，即4C/2C 也更大；而低活力种子则由于 DNA 复制等代谢活动缓慢，特定时间点的4C 核比例较低，萌发滞缓期也更长。Lv 等［87］报道称紫花苜蓿和白三叶种子吸水24 h 的4C/2C 与田间出苗率显著正相关，可用于种子活力的测定。而Cheshmi 等［117］认为吸水18 h 的4C/2C 可更加精确反映紫花苜蓿种子活力。采用流式细胞技术测定牧草种子活力，应该注重解离液的选择，如紫花苜蓿种子适宜的解离液为LB01［88］。

6.3 呼吸速率与ATP 含量

有研究表明牧草种子活力与种子呼吸速率和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量等生理指标紧密相关。草地雀麦种子呼吸速率和草产量显著正相关［149］。Ching［237］也发现绛车轴草和多花黑麦草种子吸水初期的 ATP 含量与种子活力显著正相关。然而孙丽萍等［234］认为呼吸速率无法准确测定红豆草和伏地肤种子活力。

其他生理生化及分子生物学手段如测定脂肪酸、蛋白质、激素、酚醛类物质含量、Ca2+流速、代谢酶活性和关键基因表达量等目前主要用于农作物的种子活力评价，在牧草中研究和应用较少。原因可能在于这些方法操作较为烦琐且成本高昂，重复性差，此外牧草种子生物学基础研究滞后于主要农作物，缺乏相关活力测定方法的理论基础与科学依据。

7 基于计算机和光学成像技术的牧草种子活力测定

随着计算机和光学成像等新技术的快速发展和推广利用，国内外许多学者将这些技术与种子活力测定结合起来，实现了种子活力的快速和无损检测。国内外常用的光学检测技术主要包括多光谱、近红外光谱、高光谱成像、X 光光谱以及红外热成像等技术［238］。运用计算机和光学成像技术有检测耗时短、分辨率高、对种子无损以及精确度高等显著优势，尤为适合对数量稀少、珍贵的种质资源进行检测。目前光学成像技术在活力测定上的应用主要集中在农作物以及蔬菜种子。在牧草方面，韩亮亮等［239］运用近红外光谱技术结合主成分-马氏距离模式鉴别了3 种不同活力燕麦种子，鉴别率达到了 100%。Zhang 等［240］利用多光谱成像系统收集了不同波长下紫花苜蓿种子形态和光谱信息，并结合线性判别分析和规范化典型判别分析，在鉴别高活力种子和预测种子发芽率方面准确率高达95.7%。Wang 等［241］也发现多光谱成像系统可无损地鉴定紫花苜蓿种批中的老化和低活力种子。

目前计算机和光学成像技术在牧草种子活力检测方面依然有较大发展空间，当前的研究主要集中在光谱数据的处理、模型建立与算法选择等方面，较少开展光学检测机理的研究。此外目前依然缺乏特定牧草种及品种的光谱数据与活力的定量关系，在运用该方法进行种子活力测定前，需要针对特定种或品种，建立光谱数据与活力指标的相关性。另外近红外、多光谱等成像系统普遍价格昂贵，限制了这些方法的充分应用。

8 牧草种子活力测定与评价研究展望

当前在全球气候变化、保障食物安全、生态文明建设以及实行种业创新国家战略的大背景下，牧草种子作为人工草地建植和天然草地改良的基础材料，其种子活力的基础研究和测定评价愈发突显出重大的意义。然而目前相较于农作物，牧草种子活力的形成调控、种子老化机制（自然老化、人工老化及其差异）基础研究较为单薄。在农作物上，诸如水稻（Oryza sativa）OsIAGLU［242］、OsPER1A［243］，玉米ZmGOLS2［244］，小麦（Triticum aestivum）TaNAC2［245］等基因均已被证明在调控种子活力中发挥关键作用，而相关研究在牧草中则较少。应重视借鉴农作物上的研究基础与经验，开展牧草种子发育和活力形成调控机制的生物学基础研究，这可为提高牧草种子产量质量，开辟活力测定的新方法提供重要理论基础。同时，可采用种子引发、包衣和丸粒化等技术手段进行牧草种子活力的人为调控，以确保生产上成功建植。

目前草种子活力测定的研究主要集中在重要牧草和饲料作物上，而 ISTA 活力委员会十分鼓励针对广泛物种的活力测定研究［246］。有研究表明RE、EC 等方法在乡土植物种子活力测定方面具有重要潜力［247］，未来应扩展研究物种的多样性，尤其是针对耐寒、旱、盐碱的优质特色乡土草种开展种子活力评价的研究，开发出切实可行的活力评价方法，以促进我国寒旱区、盐碱地的草牧业发展和生态改良。

牧草主要集中在豆科和禾本科两科，其中部分豆科植物种子的硬实、禾本科植物种子的休眠和半透层可能给牧草种子活力测定带来障碍。对硬实和休眠种子的活力测定，须采取不涉及萌发和幼苗评价的方法，重点考虑从生理生化特性和分子标记的角度入手开展活力评价，另外针对种子休眠和硬实调控机制的研究也可为活力测定提供重要科学依据。对于有半透层的禾本科牧草种子应加强半透层定位、形成发育机制的基础研究，为开发适宜于有半透层种子的活力评价方法提供理论基础。

目前的牧草种子活力评价方法主要集中在萌发特性、幼苗评定和生理特性等传统方法，而随着电子信息和光学技术的发展，今后牧草种子的无损检测是重要发展趋势。应开展牧草种子光学检测机理研究，通过对种子光学特征、化学组分和活力相关代谢的研究，为光学技术开展牧草种子活力检测提供理论基础。此外针对重要牧草种和品种，建立算法模型和种子光谱数据库，以便于技术从实验室到生产的转化。另外开发小型便携设备也将大大促进这些技术在牧草种子活力检测中的应用。

此外还应重视牧草种子活力测定的标准化问题。尽管当前针对牧草种子活力测定的研究较多，但经过ISTA 标准化的测定方法较少。无论哪种活力评价方法，均应明确揭示因为活力的差异而导致的商品化牧草种子在田间建植或储藏性能方面的差距，因此开展多种批研究对技术的标准化具有重要作用。今后应借助ISTA等平台，加强跨地区、国际化的实验室沟通协作，采用多个商业种批开展研究，严格验证活力测定方法的准确性、普适性和可重复性，最终实现技术方法的标准化。