大狼毒对紫花苜蓿幼苗生理及内源激素含量的影响

单贵莲，马祖艳，李嘉懿，刘洋，谢勇，刘佳，初晓辉

（1. 云南农业大学草业科学系，云南 昆明 650201；2. 德州市庆云县自然资源局，山东 德州 253700；3. 云南省林业和草原局，云南 昆明 650224；4. 云南省昆明市动物疫病预防控制中心，云南 昆明 650223；5. 香格里拉市林业和草原局，云南 迪庆 674499）

大狼毒（Euphorbia jolkinii），又名土瓜狼毒，属大戟科多年生草本植物，广泛分布于滇西北高寒草甸［1-3］。大狼毒根系发达且扎根深，产种量大，抗寒抗旱能力强，在高寒退化草地生境中有极强的生存优势，目前已成为滇西北退化高寒草甸的主要毒害草，被列为当地天然草原的本土入侵植物（native invasive plant）［2-3］。有研究显示，大狼毒在滇西北高寒草甸的入侵扩散致使草地植物密度及可食牧草占比显著下降，毒害草占比显著增加，草地群落单一化，植物物种丰富度和多样性显著下降［4-5］。大狼毒的存在对草甸植物的多样性具有显著的负面影响，化感作用可能是大狼毒入侵草地物种多样性锐减的主要原因之一［4］。

化感作用（allelopathy）是指植物在其生长发育过程中，通过释放低分子有机酸、萜类、酚类等化感物质改变其周围微生态环境，进而导致同一生境中植物之间相互排斥或促进的一种自然现象［6］。化感作用在草地演替中发挥着十分重要的作用［7-10］。植物会通过化感作用增强竞争能力、影响伴生植物的萌发生长，进而改变群落物种的分布格局［7，11-16］，驱动群落演替［9，16-18］。如刘雅婧等［12］研究表明，狼毒（Stellera chamaejasme）浸提液对紫花苜蓿（Medicago sativa）等3 种牧草萌发生长产生明显的抑制作用。Zhu 等［13］研究表明，狼毒根系分泌物通过改变土壤有效养分和pH 值，进而影响羊草（Leymus chinensis）的生长并引起群落的演替。靳瑰丽等［14］研究表明醉马草（Achnatherum inebrians）水浸液对伴生植物种子萌发及幼苗生长产生不同程度的抑制作用，其抑制程度随水浸液浓度增加而逐渐上升。王辉等［15］研究发现，舟叶橐吾（Ligularia cymbulifera）水浸液抑制了3 种牧草的种子萌发和幼苗生长，以根部抑制程度强于茎叶。李彦飞等［16］研究表明，大狼毒水浸提液对苜蓿种子萌发及幼苗生长产生化感抑制作用，以根部抑制作用强于茎叶和根部土壤。王紫媛等［17］研究指出，大狼毒水浸提液会对优良牧草的种子萌发和幼苗生长产生化感抑制作用，以对种子萌发的抑制强于对幼苗生长的抑制。邓文红［18］研究显示黑沙蒿（Artemisia ordosica）浸提液会影响伴生植物的萌发生长，进而影响群落的演替。

大狼毒植株体内含有的二萜、三萜、苯丙素类等化学物质［19］究竟会引起牧草生长和生理上的哪些变化？目前还鲜见研究。据此，本研究以适宜滇西北高寒牧区自然气候条件的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿（M.sativa‘Amerigraze 401+Z’）为受体材料，开展大狼毒不同部位粉碎物对紫花苜蓿幼苗生长、生理及内源激素含量的影响研究，通过研究探讨大狼毒蔓延区草地物种多样性锐减的原因，为评估大狼毒对草地物种多样性的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 大狼毒植株及根部土壤的获取 2019 年8 月中旬大狼毒盛花期，于滇西北亚高山草甸挖取大狼毒完整植株，将根部和茎叶分开，清洗、晾晒、粉碎备用。同步采集土层深度为0～20 cm 的大狼毒根部周围土壤（5 cm 范围内），风干、捣碎备用。

1.1.2 紫花苜蓿来源及品种特性 受体材料为‘牧歌401+Z’紫花苜蓿（由北京正道种业有限公司提供），该品种产量高、品质优、抗性强，适合用于滇西北高寒牧区改良天然草地及建植人工草地［20］。

1.2 测定指标与方法

参考周淑清等［21］的方法，将大狼毒粉碎物按不同用量（0、1、2、3 g）添加到穴盘中，通过粉碎物腐解释放化感物质的方法，开展其对紫花苜蓿生长及生理的影响研究。具体为：2020 年5 月中旬，分别称取0 g（设为对照，CK）、1 g（Y1）、2 g（Y2）、3 g（Y3）大狼毒根、茎叶、根部土壤粉碎物，与珍珠岩混合均匀后放到体积为400 mL 的穴盘中（每用量设5 次重复），在每穴盘中播种50 粒紫花苜蓿种子，将穴盘放置在云南农业大学草学基地温室大棚，正常水肥管理，待苜蓿生长至分枝期，参照曾兵等［22］的方法，测定紫花苜蓿株高（垂直高度）、根系长度和单株鲜重。参照王学奎［23］的方法，采用分光光度法测定叶绿素a、b 含量，TTC 法测定根系活力，紫外吸收法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，NBT 光还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，比色法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性。参照焦奎等［24］的方法，利用酶联免疫法测定赤霉素（gibberellic acid，GA）、玉米素（zeatin，ZT）、吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0 进行One-way ANOVA 方差分析及Duncan 多重比较。参照Muhammas 等［25］的方法计算化感效应指数（inhibitory rate，RI）及综合化感效应（synthetical effect，SE），计算公式为：

式中：C为对照组，T为处理组；RI和SE反映化感效应的强弱，＜0 表示抑制效应，＞0 表示促进效应，绝对值大小表示作用强度［25］。

2 结果与分析

2.1 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生长的影响

与CK 相比，1 g 大狼毒根部土壤的添加可显著提高苜蓿的株高（P＜0.05），2 和3 g 大狼毒根部土壤的添加对苜蓿株高无显著影响；不同用量根、茎叶粉碎物的添加显著降低了苜蓿的株高（P＜0.05），且降低程度随添加量的增加而增加（图1A）。与CK 相比，1 g 大狼毒根部土壤的添加对苜蓿根系的生长有一定的促进作用，但促进效果不显著，2、3 g 大狼毒根部土壤的添加显著促进了苜蓿根系的生长（P＜0.05）；茎叶、根粉碎物的添加显著抑制了苜蓿根系的生长（P＜0.05），且抑制作用随添加量的增加而加强（图1B）。与CK 相比，大狼毒根部土壤的添加对苜蓿鲜重无明显影响；根、茎叶粉碎物的添加显著抑制了苜蓿有机物质的积累，导致苜蓿地上部单株鲜重显著下降（P＜0.05），且下降幅度随添加量的增加而增加（图1C）。

图1 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗形态的影响Fig.1 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa morphology

添加1 g 大狼毒根部土壤促进了苜蓿幼苗的生长，添加2、3 g 大狼毒根部土壤对苜蓿幼苗生长无促进作用。大狼毒根、茎叶粉碎物的腐解对苜蓿幼苗生长产生明显的抑制作用，且抑制强度随添加量的增加而加强，原因可能是大狼毒植株体内含有的化学物质抑制了受体植物的生长［19］。大狼毒不同部位粉碎物的综合化感效应以根强于茎叶，又以茎叶强于根部土壤（图2）。

图2 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗形态的综合化感效应Fig. 2 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa morphology

2.2 大狼毒对紫花苜蓿幼苗生理的影响

2.2.1 对叶绿素含量的影响 叶绿素含量是反映植物光合能力的一个重要指标，叶绿素含量越高，植物光合能力越强［23］。与CK 相比，添加大狼毒根部土壤可增加苜蓿叶绿素a、b 含量，以添加2 g 处理叶绿素a、b 含量最高，比对照分别增加了30.0%和14.9%。大狼毒茎叶、根粉碎物的添加使紫花苜蓿叶绿素a、b含量显著降低（P＜0.05），下降幅度随添加量的增加而增加（图3A，B）。

图3 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa chlorophyll contents

2.2.2 对根系活力的影响 根系活力是根系功能的主要衡量指标，其对植株地上部生长及营养状况等有直接的影响［23］。与CK 相比，大狼毒根部土壤的添加可显著增强苜蓿幼苗的根系活力（P＜0.05），茎叶、根粉碎物的添加会导致苜蓿幼苗根系活力显著下降（P＜0.05），且下降幅度随添加量的增加而增加，以添加根粉碎物下降最为显著（图4）。

图4 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗根系活力的影响Fig. 4 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa root activity

2.2.3 对抗氧化酶的影响 SOD 是植物体内抗氧化防御体系的关键酶，它可将O2-歧化成H2O2和O2［23］。与CK 相比，添加不同用量大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿SOD 活性显著下降；添加不同用量大狼毒茎叶、根粉碎物后，紫花苜蓿SOD 活性显著增加（P＜0.05）（图5A）。POD 和CAT 可以将植物体内的H2O2分解成H2O 与O2，清除活性氧的积累，减少其对植物细胞的损害［23］。与CK 相比，添加不同用量大狼毒根部土壤处理下，紫花苜蓿POD 活性均无显著变化；添加不同用量大狼毒茎叶、根粉碎物处理下，紫花苜蓿POD 活性显著增强（P＜0.05）（图5B）。添加1 g 大狼毒根部土壤处理下，紫花苜蓿CAT 活性下降不显著，添加2、3 g 大狼毒根部土壤处理下，紫花苜蓿CAT 活性显著降低（P＜0.05）；添加不同用量大狼毒茎叶和根粉碎物后，紫花苜蓿CAT 活性显著增强（P＜0.05）（图5C）。

图5 大狼毒粉碎物对苜蓿抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa antioxidant enzymes activity

大狼毒不同部位粉碎物的综合化感效应以根系强于茎叶，又以茎叶强于根部土壤。大狼毒根部土壤对受体植物生理平衡的维持有促进作用，添加2 g 根部土壤处理下促进效果最明显，之后下降。大狼毒根、茎叶粉碎物的添加破坏了苜蓿的生理平衡，且破坏程度随添加量的增加而增强，分析原因为大狼毒含有的化感物质使苜蓿生理平衡受到破坏，苜蓿幼苗产生应激反应，体内产生过量过氧化物，为清除过氧化物，维持膜系统稳定及自身的生理平衡，苜蓿抗氧化酶活性增强（图6）。

图6 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗生理的综合化感效应Fig. 6 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa physiology

2.3 大狼毒对紫花苜蓿幼苗内源激素含量的影响

GA 可促进植物生长发芽、开花结果及果实发育［26］。 与CK 相比，大狼毒根、茎叶、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗体内GA 含量显著下降（P＜0.05）。体现为：与CK 相比，添加1、2、3 g 大狼毒根部土壤处理后，紫花苜蓿幼苗体内GA 含量分别下降了9.1%、11.3%和12.9%；添加1、2、3 g 大狼毒茎叶粉碎物处理后，GA 含量分别下降了10.7%、11.6%和13.0%；添加1、2、3 g 大狼毒根粉碎物处理后，GA 含量分别下降了11.6%、12.8%和14.9%（图7A）。

图7 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗内源激素含量的影响Fig.7 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa endogenous hormone contents

ABA 作为一种胁迫响应激素，启动植物体内一些保护反应，从而使植物对外界非生物因子的胁迫具备一定的适应性［26］。大狼毒根、茎叶、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗体内ABA 含量升高，与CK 相比差异显著（添加1 g 根部土壤处理除外）（P＜0.05），上升幅度以茎叶、根粉碎物处理高于根部土壤处理（图7B）。

ZT 属于细胞分裂素的一种，其主要作用是控制细胞分裂、叶衰老和营养的分配等［26］。 与CK 相比，大狼毒根、茎叶、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗体内ZT 含量显著下降（P＜0.05），且下降幅度随添加量的增加而增加（图7C）。

IAA 对植物的作用主要是促进细胞的生长。与CK 相比，大狼毒根、茎叶、根部土壤粉碎物的添加显著降低了苜蓿幼苗体内的IAA 含量（P＜0.05），且下降幅度随添加量的增加而增加。具体为：与CK 相比，添加1、2、3 g根部土壤处理下，紫花苜蓿幼苗体内IAA 含量分别下降了3.7%、5.2%和10.2%；添加1、2、3 g 茎叶粉碎物处理后，IAA 含量分别下降了2.5%、5.2%和7.2%；添加1、2、3 g 根粉碎物处理后，IAA 含量分别下降了6.2%、7.5%和10.2%（图7D）。

大狼毒对苜蓿幼苗内源激素合成的综合化感效应为负值，即大狼毒粉碎物的添加抑制了苜蓿幼苗内源激素的合成，且抑制强度随粉碎物添加量的增加而增加；不同部位的抑制效果以根部土壤、根粉碎物强于茎叶粉碎物（图8）。

图8 大狼毒粉碎物对苜蓿幼苗内源激素的综合化感效应Fig. 8 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa endogenous hormones

3 讨论

前人研究指出，狼毒、黄花棘豆（Oxytropis ochrocephala）等草原毒害草可分泌化感物质抑制其他植物的生长［12，26-30］。本研究表明，大狼毒根部土壤可促进紫花苜蓿幼苗的生长，但促进效果不明显。原因可能是大狼毒强烈的养分竞争能力使其根部土壤中富集了较多的营养物质［2］，根部土壤的添加增加了营养物质的供给，因此促进了苜蓿幼苗的生长。大狼毒植株粉碎物的添加抑制了苜蓿幼苗的生长，且抑制作用随粉碎物添加量的增加而增强，原因可能是大狼毒植株体内含有的化学物质破坏了苜蓿幼苗的生理平衡，进而影响其生长。

草地有毒植物体内含有的化感物质会对受体植物幼苗的生理代谢产生影响［28，30-32］。如程巍等［28］研究表明，狼毒根系水提液提高了4 种高寒草甸常见植物幼苗丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶活性。李翔等［30］研究表明黄花棘豆水提液处理降低了燕麦（Avena sativa）幼苗的根系活力和叶绿素含量，提高了MDA含量及SOD、POD、CAT 活性。高玉莲等［32］指出，狼毒根提取液会导致燕麦、高粱（Sorghum bicolor）MDA 含量增加，POD、SOD 活性增强。本研究显示，大狼毒茎叶、根粉碎物的添加导致紫花苜蓿根系活力下降，叶绿素合成受阻，SOD、POD、CAT 等保护酶活性增强。表明大狼毒体内所含化学物质使紫花苜蓿幼苗组织产生过量过氧化物，为阻止细胞膜脂过氧化，维持膜系统稳定及自身的生理平衡，紫花苜蓿幼苗启动应激反应，通过提高SOD、POD、CAT 等保护酶活性来清除活性氧，维持膜系统稳定。大狼毒根部土壤的添加增加了苜蓿生长环境中营养物质的供给［2］，促进了苜蓿幼苗叶绿素的合成，提高其根系活力，进而促进苜蓿幼苗的生长。

植物激素在植物生长发育及抗逆性等方面起重要的调控作用［33］。通过调控植物激素的合成与代谢影响植物生长是化感作用的重要途径［34］。郭伟等［35］指出，化感物质的添加会对生菜（Lactuca sativa）内源激素产生影响，随着化感物质浓度的增加，生菜幼苗IAA、GA 含量逐渐降低，ABA 含量逐渐增加。季丽萍［36］研究表明，瑞香狼毒根水浸提液处理会导致紫花苜蓿幼苗ABA 含量升高，GA、ZT 含量降低。李保珠等［37］研究认为在环境胁迫条件下，植物通过激活ABA 的合成，从而提高抗逆性。本研究表明，大狼毒粉碎物的添加使紫花苜蓿幼苗GA、IAA、ZT合成受阻，由此推测大狼毒体内含有的化感物质可能使紫花苜蓿幼苗细胞壁收缩，降低其对水分的吸收，α-淀粉酶合成受阻，植株体内营养物质不能积累，由此限制细胞生长分裂，影响膜系统的功能［34-35］，从而抑制紫花苜蓿的生长，加速其老化。

综上，大狼毒体内含有的化感物质会破坏受体植物的生理平衡，降低GA、ZT、IAA 的合成，进而影响受体植物的幼苗生长。对大狼毒入侵草地而言，其对伴生植物的化感抑制作用会导致草地物种多样性降低［16］。补播优良牧草是提高大狼毒型退化草地物种多样性、恢复其畜牧业生产功能的常用措施，但选择补播草种时必须考虑其化感耐受性［16］。今后，应进一步以披碱草（Elymus dahuricus）、多年生黑麦草（Lolium perenne）、西南野古草（Arundinella hookeri）、鸭茅（Dactylis glomerata）、紫花苜蓿、红三叶（Trifolium pratense）、百脉根（Lotus corniculatus）等适宜高寒地区退化草地补播治理的优秀草种为受体材料，开展不同草种化感耐受性方面的比较研究，筛选萌发生长受大狼毒化感影响较小的草种补播，促进大狼毒入侵草地的恢复治理。

4 结论

大狼毒植株粉碎物的添加会导致紫花苜蓿根系活力下降，抗氧化酶活性增强，叶绿素及GA、ZT、IAA 合成受阻，进而显著抑制其幼苗生长（P＜0.05）。大狼毒根部土壤的添加一方面会促进紫花苜蓿叶绿素的合成，提高其根系活力，另一方面又会阻碍GA、ZT、IAA 的合成，最终表现为对紫花苜蓿幼苗生长无显著影响。大狼毒不同部位粉碎物对苜蓿幼苗生长及生理的综合化感效应强弱顺序为根强于茎叶，茎叶强于根部土壤，对内源激素合成的综合化感效应强弱顺序为根部土壤强于根，根强于茎叶。