复方浓缩乳清蛋白粉增强免疫力功能研究

文 柏金霞* 张彩雯 王芸芳 陈莉 宋燕华 .浙江索契壹营养科技有限公司；.浙江省疾病预防控制中心

本文目的为探讨复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠免疫力功能的影响。参照《保健食品检验评价技术规范（2003版）》的方法，设置空白对照组（去离子水），持续30d，分别用0.5、1.0、3.0g/kg体重3个剂量的浓缩乳清蛋白粉对小白鼠进行连续灌胃。对小鼠进行细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能试验和NK细胞活性测定。结果显示，各剂量组对小鼠体重增长、脏器/体重比值、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、单核-巨噬细胞碳廓清能力、血清溶血素水平、抗体生成细胞数、NK细胞活性均无显著性影响。足跖增厚实验中，中、高剂量组小鼠足跖厚度差值较阴性对照组增高（P<0.05）。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验中，高剂量组的巨噬细胞吞噬指数较阴性对照组显著增加（P<0.05）；中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬百分率比阴性对照组有升高（P<0.05）。复方浓缩乳清蛋白供试样品对细胞免疫功能以及单核巨噬细胞功能均具有显著的提升作用，研究表明复方浓缩乳清蛋白粉具有提高小鼠免疫力的作用。

先天性免疫与后天性免疫的共同作用，形成宿主免疫功能。前者对病原体反应迅速且非特异性，而后者反应较慢但特异性强，产生长期免疫记忆。人体通过免疫系统的作用进行防御。当免疫力下降时，机体的反应能力下降，不能快速的发现、排除、消除“异己”，从而引发疾病。机体免疫功能会随着环境的变化而改变，并且免疫力低下的人群也在逐年增加。

乳清蛋白目前可通过现代化技术从牛奶中获得，其氨基酸比例较完美，且易被消化和吸收。不仅如此，它还能在消化过程中生成多种肽类物质，具有生物活性。研究发现，它能帮助人体生长发育，还具有提高免疫力、缓解疲劳等功能。乳清蛋白还富含免疫球蛋白、乳铁蛋白（LF）。免疫球蛋白也是母乳中常见的免疫成分之一，目前，仅有IgG形式能通过胎盘，是帮助新生儿对抗外界病毒、细菌入侵的主要活性物质。LF是参与血清铁转运的铁结合蛋白，约占全部蛋白质的1/5，是母乳中重要的乳清蛋白成分。LF在人和牛乳中均可发现，主要由中性粒细胞和几种粘膜细胞分泌产生，并有防御病毒侵染的作用。

唾液酸自身的衍生物高达50多种，N-乙酰神经氨酸是其中最重要的一种，是大部分高等脊椎动物组织存在的形式，因此，它被广泛认为是唾液酸的主要成分。N-乙酰神经氨酸的运用非常广泛，在食品领域中可作为提高记忆力和智力、预防阿兹海默症、维持肠道的健康、提升机体免疫能力等功效的原料。

基于上述考虑，参照评价技术规范的试验要求，本研究以浓缩乳清蛋白粉、N-乙酰神经氨酸、低聚半乳糖为原料制备的复方浓缩乳清蛋白粉为对象对小鼠进行了免疫力功能影响的研究，为其在免疫力功能相关产品的应用开发提供参考依据。

1.材料和方法

1.1 试验样品

复方浓缩乳清蛋白粉由本公司自主研发，主要活性成分为N-乙酰神经氨酸、免疫球蛋白IgG、LF（来自于浓缩乳清蛋白粉）。复方浓缩乳清蛋白粉的人群推荐量如下：8-20kg幼儿及儿童为2g/d，20-40kg儿童及青少年为4g/d，40kg以上青少年及成人为6g/d。本实验采用最低人推荐服用量0.1g/kg/d进行剂量设置。试验前将样品溶于去离子水，并配制成不同浓度的溶液，在混合均匀后使用。

1.2 动物筛选和检验条件

实验动物使用许可证号：SYXK(浙）2013-0190。上海喜普-必凯实验动物有限公司提供ICR小鼠，生产许可证号：SCXK(沪）2013-0016，SPF级，均为雌性，小鼠体重18-22g。饲料来源于浙江省实验动物中心，符合《浙江省实验动物中心饲料质量标准》的规定。小鼠试验环境为屏障环境，确保实验室的环境控制在20-24℃的恒定温度和40-70%的恒定相对湿度，动物需提前4天适应。

1.3 剂量设计

低剂量组：0.5g/kg的标准喂养小鼠，是人体推荐量的5倍；中剂量组：1.0g/kg标准喂养小鼠，是人体推荐量的10倍；高剂量组：3.0g/kg标准喂养小鼠，是人体推荐量的30倍。各剂量组分别称取待试产品2.5g、5.0g和15.0g，加入去离子水配制成浓度为0.05、0.10和0.30g/mL的三种溶液，作为试样从口灌入小鼠胃中，灌入胃的量按0.1mL/10g计算。

1.4 主要仪器和试剂

光学显微镜；CO2培养箱；721分光光度计；酶标仪；RPMI1640细胞培养液；小牛血清；Hank’s液；YAC-1细胞；碳酸钠；氯化钠；印度墨汁；去离子水。

1.5 实验方法

脏器/体重值的测试方法：受试样品灌入各组小鼠胃中，每天一次，持续30d后处死小鼠，从中取出胸腺和脾脏，并进行称重，确定胸腺与体重的比值以及脾脏与体重的比值。

其他免疫指标测定：按照评价技术规范进行以下实验：采用MTT法进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验、采用足跖增厚法进行绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH实验、采用血凝法进行小鼠血清溶血素测定、采用Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定、采用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、小鼠碳廓清实验、采用LDH测定法进行NK细胞活性测定。

1.6 试验数据统计

使用SPSS软件对数据进行分析。

2.结果

2.1 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠体重的影响

结果显示，各剂量组小鼠体重在整个实验过程中与阴性对照组对比均无显著差异（方差分析，P>0.05）。表明不同剂量的样品对小鼠体重无影响。

2.2 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠脏器与体重比值的影响

结果显示，各剂量组小鼠胸腺与体重的比值以及脾脏与体重的比值均与阴性对照组无显著差异（方差分析，P>0.05）。表明各浓度样品不改变小鼠的免疫器官体重比值。

2.3 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠细胞免疫功能的影响

由实验可知，各剂量组小鼠淋巴细胞增殖能力光密度差值较阴性对照组相比均无显著性（方差分析，P>0.05）。但中、高剂量组小鼠左后足跖部厚度较阴性对照组显著增加（q检验，P<0.05）。

表1 复方浓缩乳清蛋白粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力和绵羊红细胞诱导小鼠DTH的影响（±S）

表1 复方浓缩乳清蛋白粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力和绵羊红细胞诱导小鼠DTH的影响（±S）

注：q检验：与阴性对照（去离子水）比较，＊.P<0.05。

组别 动物数（只） 光密度差值 左后足跖部厚度差（mm）24小时阴性对照 10 0.475±0.041 0.32±0.10低剂量组 10 0.453±0.067 0.39±0.09中剂量组 10 0.451±0.081 0.46±0.17＊高剂量组 10 0.494±0.069 0.51±0.15＊P值 0.428 0.015

2.4 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠体液免疫功能的影响

由实验可知，与阴性对照组比较，各剂量组小鼠溶血素抗体积数值、溶血空斑数均无显著性（方差分析或秩和检验，P>0.05）。

2.5 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠单核－巨噬细胞功能的影响

为符合方差齐性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2对吞噬百分率的结果进行变换。由试验数据可知，与阴性对照组比较，在半体内法实验中，中、高剂量组的吞噬百分率和高剂量组吞噬指数均显著升高（q检验，P<0.05）。在小鼠碳廓清实验中，各剂量组的吞噬指数与阴性对照组相比，无显著差异（方差分析，P>0.05）。

2.6 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠NK细胞活性的影响

为符合方差齐性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2对NK细胞活性的结果进行变换。结果显示，较阴性对照组，各剂量组小鼠NK细胞活性无显著差异（方差分析，P>0.05）。

表2 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞和小鼠碳廓清试验吞噬指数的影响（±S）

表2 复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞和小鼠碳廓清试验吞噬指数的影响（±S）

注：q检验：与阴性对照（去离子水）比较，＊.P<0.05。

吞噬指数（碳廓清试验）阴性对照 10 21.6±8.8 0.33±0.09 6.95±0.57低剂量组 10 21.4±3.8 0.30±0.06 6.85±0.85中剂量组 10 30.2±8.1＊ 0.42±0.10 6.86±0.95高剂量组 10 32.6±9.2＊ 0.51±0.18＊ 6.96±0.51 P值 0.003 0.002 0.980组别 动物数（只）吞噬百分率（%）吞噬指数（巨噬细胞吞噬鸡红细胞）

总结与展望

人体免疫系统是由三道屏障组成的保护机体免受疾病原菌侵害的重要防御系统。身体抵御病原侵袭的第一道屏障是能有效阻止大多数细菌、真菌、寄生虫、病毒侵袭的皮肤和粘膜；第二道屏障由体液中的溶菌酶等杀菌物质和具有吞噬、防卫功能的细胞群体组成；第三道屏障抗体主要来源于免疫细胞。第一道屏障和第二道屏障是每个人与生俱来的，这是长期进化产生的结果，可防御大多数入侵的病原微生物，这种保护性生理功能称为非特异性免疫。第三道屏障是指体内的T、B细胞在接受“非自身”的物质侵入后，经过感应、反应和效应几个不同的应答阶段，从而进行抗原清除的一系列过程，这个过程又叫免疫特异性。人体免疫系统需要相互协调、相互配合，2种免疫方式缺一不可。研究表明，N-乙酰神经氨酸可在黏膜表面与流感病毒、冠状病毒等竞争性结合，减少病毒与黏膜上的受体结合，从而保护宿主细胞，增强黏膜防御系统。乳铁蛋白可通过铁依赖和铁不依赖的机制与细菌竞争铁营养，抑制细胞内细菌的生长达到广谱抑菌作用；同时，乳铁蛋白通过不同机制与病毒受体结合阻止病毒进入细胞。“特异性抗体”通常被称作“免疫球蛋白”，它们通过B细胞分化形成，具有特异性免疫功能，它们通过与抗原进行特定反应，来抵御疾病。免疫球蛋白IgG作为人类免疫系统的重要组成部分，在血清及其他组织的分泌水平都较高，并具可进行重复免疫应答，且目前仅其可通过胎盘。

研究结果表明，不同剂量的复方浓缩乳清蛋白粉经口给予小鼠30d，不会引起各组间小鼠体重增长差异，各组间小鼠脾脏与体重的比值以及胸腺与体重的比值也均无差异。在足跖增厚试验中，中、高剂量组小鼠足跖厚度差值较阴性对照组显著增高（P<0.05）。在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验中，与阴性对照组相比，高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬指数显著升高（P<0.05）；中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬百分率升高（P<0.05），表明复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠细胞免疫及单核-巨噬细胞吞噬功能阳性。依据评价技术规范中增强免疫功能的评价规定：在体液免疫功能、细胞免疫功能、NK细胞活力、单核-巨噬细胞功能中，任意2项检测结果为阳性，均可表明样品具有此功能。因此，结论提示，复方浓缩乳清蛋白粉对小鼠具有增强免疫力的功能，具备一定的开发的价值。