非肌层浸润膀胱癌组织中核糖核酸结合蛋白15及泛素特异性肽酶24表达的临床预后意义

何丹,石艳宏,王峥,张晓炜,王冠杰

非肌层浸润膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer,NMIBC)是最常见的膀胱癌类型,治疗手段包括手术、灌注化疗等,但肿瘤术后极易复发[1-2]。寻找能够反映患者预后的肿瘤标志物,具有重要临床意义。核糖核酸结合蛋白15(RNA binding motif protein 15,RBM15)是一种甲基转移酶,参与mRNA N6-甲基腺苷修饰(N6-methyladenosine,m6A)。研究发现,RBM15在鼻咽癌、肾癌等肿瘤中表达增加能促进肿瘤免疫抑制微环境形成,导致肿瘤侵袭和转移[3-4]。泛素特异性肽酶24(ubiquitin specific peptidase 24,USP24) 属于半胱氨酸蛋白酶家族成员,能够与底物蛋白上的泛素分子结合,发挥去泛素酶活性[5]。另有研究发现,肺癌、急性淋巴细胞白血病等肿瘤中USP24的过度表达能抑制肿瘤细胞凋亡,发挥肿瘤促进作用[6-7]。本研究通过检测膀胱癌组织中RBM15、USP24的表达,探讨两者的临床意义,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2020年1月西安市中心医院肿瘤科诊治NMIBC患者90例为研究对象,男52例,女38例,年龄33～79 (63.17±4.78)岁;有吸烟史40例;肿瘤数目:单发63例,多发27例;肿瘤分期:T1期50例,Ta/Tis期40例;病理分级:低级别尿路上皮癌47例,高级别尿路上皮癌43例;肿瘤大小:>3 cm者29例,≤3 cm者61例。本研究获得医院伦理委员会审核批准通过(2017MJ076),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①患者均接受经尿道膀胱肿瘤电切,经术后病理明确诊断为NMIBC;②首次诊治,术前未接受其他治疗;③临床资料和随访资料完整。(2)排除标准:①合并其他器官恶性肿瘤;②合并严重肝肾功能障碍;③合并严重尿道狭窄、脊柱畸形及凝血功能障碍等经尿道手术禁忌证者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 膀胱癌组织USP24、RBM15蛋白表达:术中留取膀胱癌组织和癌旁组织,10%中性甲醛固定后,常规石蜡包埋切片,常规进行免疫组化染色。USP24兔单克隆抗体购于英国Abcam公司(货号ab129064)。RBM15兔多克隆抗体购自美国CST公司(货号60386)。组织标本梯度酒精脱水后中性树脂包埋,切片置于显微镜下(日本Olympus公司,型号DX31,×200),观察染色情况,每张切片随机选取5个视野﹐肿瘤细胞中出现棕褐色染色为阳性表达,浅黄色或无着色为阴性表达。根据膀胱癌组织RBM15、USP24蛋白表达,分为RBM15阳性组(n=60)和阴性组(n=30)以及USP24阳性组(n=67)和阴性组(n=23)。

1.3.2 术后随访:病理确诊膀胱癌后每3个月电话或门诊随访1次,随访内容为肿瘤复发进展及患者生存情况,随访终点为2023年2月1日。肿瘤进展定义为肿瘤发生复发、转移或发生肿瘤相关死亡。无进展生存时间(progression free survival,PFS)定义为自确诊之日至肿瘤复发、转移或肿瘤相关死亡的间隔时间。

2 结 果

2.1 NMIBC癌及癌旁组织中RBM15、USP24表达 RBM15蛋白棕黄色阳性染色位于细胞核,USP24棕褐色阳性染色位于细胞膜和细胞浆。膀胱癌组织中RBM15、USP24阳性率分别为66.67%(60/90)和74.44%(67/90),高于癌旁组织中RBM15、USP24阳性率6.67%(6/90)、11.11%(10/90),差异均有统计学意义(χ2=69.761、73.739,P均<0.001),见图1。

图1 NMIBC癌组织及癌旁组织中RBM15、USP24蛋白表达比较(免疫组织化学染色,×200)

2.2 NMIBC癌组织中RBM15与USP24表达的相关性 Spearman秩相关分析显示,NMIBC癌组织中RBM15与USP24表达呈显著正相关(r=0.716,P<0.001)。

2.3 RBM15、USP24表达在不同临床病理特征中的差异比较 NMIBC癌组织中RBM15、USP24阳性率在肿瘤分期T1期、病理分级高级别中分别高于肿瘤分期Ta/Tis期及病理分级低级别(P均<0.001),而在其他临床病理特征中比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 RBM15、USP24蛋白表达在不同临床病理参数中比较 [例(%)]

2.4 RBM15、USP24表达对NMIBC患者无进展生存预后的影响 随访期间,发生肿瘤进展36例,3年无进展生存率为60.00%(54/90)。RBM15阳性组和阴性组3年无进展生存率分别为45.00%(27/60)、90.00%(27/30)。USP24阳性组和阴性组3年无进展生存率分别为50.75%(34/67)、86.96%(20/23)。RBM15阳性组、USP24阳性组累积无进展生存率明显低于RBM15阴性组、USP24阴性组(Log Rankχ2=8.057、15.379,P=0.005、<0.001),见图2。

图2 Kaplan-Meier曲线分析RBM15、USP24表达对NMIBC患者无进展生存预后的影响

2.5 影响NMIBC患者无进展生存预后的多因素COX回归分析 以NMIBC患者是否发生肿瘤进展为因变量(1=发生,0=未发生),以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素COX回归分析,结果显示:病理分级高级别、肿瘤分期T1期、RBM15阳性、USP24阳性是影响NMIBC患者无进展生存预后的独立危险因素(P<0.01),见表2。

表2 影响NMIBC患者无进展生存预后的多因素COX回归分析

3 讨 论

膀胱癌是全球第十大常见恶性肿瘤,我国每年新发病例达8.2万例,发病率为5.8/10万,严重威胁我国人民健康[8]。NMIBC是最常见的膀胱癌类型,其发生是一个多因素、多步骤的过程,吸烟、环境中有毒物质及遗传等因素均是重要的致病因素。目前NMIBC的治疗以手术、化疗及免疫治疗为主,但由于NMIBC具有较高的异质性,且术中难以彻底切除微小肿瘤病灶,术后可发生肿瘤复发转移,导致患者死亡[9]。深入研究NMIBC发生发展的机制,寻找能够评估NMIBC患者预后的分子标志物,有利于选择相应的治疗方案及随访方案,改善高危患者的临床预后。

m6A修饰是mRNA中腺嘌呤的第6位氨基发生甲基化的修饰方式[10]。RBM15作为一种甲基转移酶,是m6A修饰的书写者,能够调控癌基因mRNA的表达,在肿瘤干细胞更新分化、免疫调节及药物敏感性等的调节中,发挥重要的生物学作用[11-12]。本研究发现,NMIBC癌组织中RBM15表达升高,提示RBM15参与NMIBC的肿瘤发生过程。NMIBC中RBM15表达升高可能与非编码RNA的表达调控有关。有学者报道,环状RNA CTNNB1能够与RBM15相互作用,增加RBM15蛋白稳定性,RBM15通过m6A修饰促进己糖激酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶的表达,促进肿瘤细胞无氧糖酵解,促进肿瘤恶性进展[13]。此外,亦有学者发现,肾癌肿瘤细胞中EP300/CBP复合体能够诱导RBM15基因启动子的组蛋白3乙酰化修饰,转录水平促进RBM15基因的表达[4]。本研究中,RBM15表达与NMIBC不良临床病理特征有关,提示RBM15促进NMIBC的肿瘤进展。分析其机制,可能是RBM15的表达影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润。有学者报道,膀胱癌组织中RBM15的表达升高能够促进髓源性抑制细胞、粒细胞的浸润,并能够促进T淋巴细胞表面程序性死亡因子1的表达,从而诱导肿瘤细胞的免疫逃逸的发生,导致患者不良预后[14]。Zeng等[4]报道,肾癌中RBM15的表达上调能够促进肿瘤细胞中CXC趋化因子配体11的分泌,促进肿瘤相关巨噬细胞浸润和M2型极化,继而增强肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭等恶性潜能。本研究中,RBM15阳性NMIBC患者无进展生存预后较差,表明RBM15是新的NMIBC预后相关肿瘤标志物。笔者分析,RBM15作为一种m6A修饰中的关键因子,其可能通过促进肿瘤干性、肿瘤抑制免疫微环境的形成,增强肿瘤细胞对化疗药物、免疫检查点抑制剂治疗的抵抗性,增加NMIBC患者肿瘤局部复发进展的风险[15]。另外,RBM15阳性表达的肿瘤细胞增殖和迁移能力显著增强,经尿道膀胱肿瘤电切术中病灶难以彻底清除,病灶周围微小转移病灶不易被发现,造成术后肿瘤复发[3]。临床医生可根据膀胱癌组织中RBM15蛋白表达,对患者临床预后进行评估,对于高危复发进展的患者予以积极化疗及随访,以改善患者临床预后。

USP24基因位于1p32.3,编码蛋白是一种去泛素酶,可以特异性识别并去除靶蛋白中的泛素分子,在蛋白质水平参与炎性反应、恶性肿瘤及帕金森病等多种疾病的病理生理学过程[3]。研究发现,肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中USP24的表达上调通过调控DNA损伤修复相关基因的表达,促进肿瘤的恶性增殖和转移,导致肿瘤进展[16]。本研究中,NMIBC中USP24表达升高,提示USP24参与NMIBC的肿瘤发生过程。USP24表达升高的机制与USP24基因的单核苷酸多态性有关。有学者报道,肿瘤基因组中USP24的单核苷酸多态性发生改变,RNA编辑异常引起突变体930C/T和7656T/C的比例显著增加,USP24-930T和USP24-7656C通过增加RNA稳定性增加USP24表达水平[17]。本研究中,USP24与NMIBC不良临床病理特征有关,提示USP24参与促进NMIBC的肿瘤进展。分析其原因,可能与USP24能够诱导NMIBC中免疫抑制微环境形成有关。研究发现,USP24的表达上调能够稳定p300蛋白,增加肿瘤细胞内核因子κB的水平,诱导肺癌细胞中白介素-6的表达,进而促进单核巨噬细胞向M2型极化,形成免疫抑制微环境,导致肿瘤细胞发生免疫逃逸,促进肿瘤进展[18]。此外,USP24可通过促进表皮生长因子受体Ser1616、Ser2047位点的磷酸化激活,增加肿瘤细胞内Bax和p300水平,促进细胞周期G1/S的转换,促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤进展[19]。本研究中,USP24阳性表达是影响NMIBC患者无进展生存预后的独立危险因素,提示检测USP24表达有助于评估NMIBC患者的临床预后。其原因可能与USP24影响化疗的敏感性有关。有研究表明,USP24能够与损伤特异性DNA结合蛋白2结合,抑制其泛素化蛋白酶体途径降解,进而促进DNA损伤修复,增强对化疗药物抵抗性[20-21]。尚有学者在急性淋巴细胞白血病中,应用WP1130直接靶向结合USP24,抑制USP24及下游髓样细胞白血病-1的表达,干扰线粒体跨膜电位,诱导肿瘤细胞凋亡[7]。因此,NMIBC中USP24的表达参与促进NMIBC肿瘤的发生发展,是NMIBC预后相关肿瘤标志物,以USP24为靶点的治疗可能是潜在的NMIBC治疗方案。本研究中,RBM15与USP24表达呈显著正相关,提示两者可能存在协同的作用关系。有学者发现,肿瘤中USP24与RBM15具有较强的相关性,USP24可通过增加RBM15蛋白的稳定性,促进癌细胞的恶性增殖和侵袭[22]。但NMIBC中两者的具体作用机制有待今后进行深入的实验研究。

综上所述,NMIBC癌组织中RBM15、USP24表达均升高,两者表达与肿瘤分期、病理分级有关,共同参与膀胱癌的疾病进展。癌组织中RBM15、USP24阳性表达NMIBC患者无进展生存预后较差,是影响患者无进展生存预后的独立危险因素。本研究尚存在一定的不足之处,一方面本研究样本量有限,未能对NMIBC患者不同类型进行分层分析,有待今后扩大样本含量进一步研究;另一方面,本研究未能对RBM15、USP24在NMIBC中具体作用机制进行研究,有待今后进行深入探索。

利益冲突：所有作者均声明无利益冲突

作者贡献声明

何丹:设计研究方案,实施研究过程,数据获取,论文撰写;石艳宏:实施研究过程,资料搜集整理;王峥:分析试验数据,论文审核;张晓炜:进行统计学分析;王冠杰:论文撰写,论文修改