基于NRF2/FPN1通路探究黄芪甲苷减轻糖尿病心肌梗死大鼠心肌损伤的作用机制*

邓长青 张京兰 金海涛

(武汉市中医医院脑病科, 湖北 武汉 430014)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的主要特征为胰岛素分泌不足、高血糖和高脂血症,属于一种代谢性疾病,其发病率逐渐上升,造成DM患者死亡的主要原因是患者发生心血管并发症,而心肌梗死是死亡率最高的并发症,推测可能与DM心肌缺血损伤有关[1-2],因此深入探索DM心肌梗死引发的心肌损伤机制有利于开发治疗方案。黄芪甲苷(Astragaloside A,AS)是从黄芪中提取的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性等广泛的药理活性,在缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,IR)损伤中可发挥保护心脏的作用[3]。据报道[4]铁稳态失衡与多种疾病有关,如心脏病、神经退行性疾病、癌症和贫血等。膜铁转运蛋白1(Ferroportin1,FPN1)是在哺乳动物中唯一被发现的与铁释放相关的跨膜蛋白,在系统性铁稳态中起关键作用[5]。核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)是抗氧化反应的关键调节因子,参与保护心肌免于铁死亡[6]。然而,AS能否通过NRF2/FPN1对DM心肌梗死心肌损伤产生影响尚不清楚。因此本研究通过建立DM心肌梗死大鼠模型,以不同浓度的AS干预,探索其对DM心肌梗死大鼠心肌损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,6周龄)购自博济医药科技股份有限公司,许可证号:SYXK(粤)2022-0279。将大鼠饲养在标准实验室条件下,其中温度为(25±2)℃,相对湿度为(60±15)%。所有实验程序均经动物护理和使用委员会批准,伦理批号:2022-06-075。

1.2 实验试剂 成都慕思生物科技有限公司购入AS(纯度≥98%);Sigma Chemical提供链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、2, 3, 5-氯化三苯基四唑(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride,TTC);Med-ChemExpress公司提供ML385;Servicebio提供Prime-Script RT试剂盒、Abcam公司提供NRF2、FPN1、谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)一抗以及铁离子试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 DM心肌梗死大鼠模型的制备及干预 所有大鼠适应性饲养5 d后,随机分为假手术组(10只)及造模组(53只),选取造模组大鼠参照刘宇等[7]方法进行制备DM大鼠模型,大鼠给予8周的高糖饲料喂养,随后腹腔注射65 mg/kg STZ,假手术组给予等体积的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射,并以普通饲料喂养。72 h后(禁食6 h),大鼠出现高血糖(血糖高于16.7 mmol/L),并伴随多食、多饮、多尿症状,则认为DM大鼠造模成功。将DM造模成功的50只大鼠(3只失败)腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉并进行心电图监测,将大鼠气管插管,在大鼠左锁骨中线第3～4肋间切开肋骨,完全暴露心脏,在距左心耳下缘2 mm,以6-0尼龙线结扎左冠状动脉前降支,当心尖区和左心室壁从红色变为白色,心电图ST段升高时,表明DM心肌梗死大鼠模型构建成功[7],假手术组仅进行开胸,但不结扎。将50只造模成功的DM心肌梗死大鼠随机分为梗死组、AS低剂量(AS-L)组、AS中剂量(AS-M)组、AS高剂量(AS-H)组、AS-H+Nrf2抑制剂(ML385)组。AS-L组、AS-M组、AS-H组分别以20 mg/kg AS、40 mg/kg AS、80 mg/kg AS灌胃干预[8];AS-H+ML385组以80 mg/kg AS灌胃,同时进行腹腔注射30 mg/kg ML385干预[9],其余各组进行等体积的生理盐水干预,1次/d,连续30 d。

1.3.2 心功能指标检测 彩超采集数据计算大鼠左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF);麻醉大鼠静脉取血,全自动生化仪分析肌酸激酶同工酶-MB(Creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平。

1.3.3 TTC染色评估心肌梗死体积比 各组随机选取3只大鼠,麻醉并使大鼠安乐死,取出心脏,在-20 ℃下冷冻30 min,然后制备组织2 mm厚切片,将切片在1% TTC缓冲液中孵育30 min,然后在10%甲醛溶液中固定24 h,对切片进行成像,Image Pro Plus 7.0软件测量心肌梗死体积,其百分比以梗塞体积与切片总体积的占比表示。

1.3.4 样本采集 麻醉并处死各组剩余7只大鼠,取出心肌组织,一部分浸泡到甲醛溶液中;另一部分于-80 ℃保存。

1.3.5 HE检测心肌组织病理学变化 取出固定于甲醛溶液中的心肌组织,然后将组织在一系列乙醇和二甲苯溶液中脱水并包埋在石蜡中,切片机将心脏组织切成4 μm厚的切片,使用苏木精和伊红染色检查组织病理学变化。

1.3.6 试剂盒检测铁离子含量 取出-80 ℃保存的心肌组织,离心后按照试剂盒说明书检测铁离子含量。

1.3.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测心肌组织中NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表达水平 Trizol试剂从心肌样品中提取总RNA。然后以Prime-Script RT试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板,通过Bio-Rad CFX Connect实时PCR检测系统进行qRT-PCR反应,使用2-ΔΔCT方法分析基因的表达,其中β-actin为参照。引物序列,见表1。

1.3.8 Western blot检测心肌组织中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表达 取出1.3.4中保存的心肌组织,采用预冷的RIPA裂解缓冲液中提取蛋白,取上清液并添加到蛋白质缓冲液中。然后测量蛋白浓度并通过SDS-PAGE凝胶分离总蛋白,之后转移到PVDF膜上,于脱脂牛奶中孵育1 h。将一抗(GPX4,1∶1000;NRF2,1∶1000;FPN1,1∶1000;β-actin,1∶1000)在4 ℃下与膜一起孵育过夜。然后在室温下加入二抗(1∶5000)孵育1 h,Image J分析NRF2、GPX4、FPN1蛋白表达水平。

2 结果

2.1 AS对各组大鼠心功能指标的影响 与假手术组相比,梗死组大鼠LVEF显著降低,CK-MB、CK显著增加(P<0.05);与梗死组相比,AS-L组、AS-M组、AS-H组大鼠LVEF显著增加,CK-MB、CK显著降低,呈现剂量依赖性(P<0.05);与AS-H组相比,AS-H+ML385组大鼠LVEF显著降低,CK-MB、CK显著增加(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠LVEF、CK-MB、CK比较

2.2 AS对各组大鼠心肌梗死体积比的影响 心肌梗死体积比:梗死组较假手术组、AS-H+ML385组较AS-H组均显著增加,AS-L组、AS-M组、AS-H组较梗死组显著降低,呈现剂量依赖性(均P<0.05),见图2。

图2 各组大鼠心肌梗死体积比比较

2.3 AS对各组大鼠心肌组织病理学的影响 假手术组大鼠无病理损伤出现;梗死组大鼠出现严重水肿、炎症发生并伴随心肌坏死;AS-L组、AS-M组、AS-H组干预后,各组大鼠病理损伤逐渐得到改善,以AS-H组改善最为显著;AS-H+ML385组水肿等病理现象较AS-H组加重。见图3。

2.4 AS对各组大鼠铁离子含量的影响 铁离子含量:梗死组较假手术组显著增加, AS-H+ML385组较AS-H组显著增加(均P<0.05);AS-L组、AS-M组、AS-H组较梗死组显著降低,呈现剂量依赖性(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠铁离子比较

2.5 AS对各组大鼠心肌组织中NRF2、GPX4、FPN1mRNA表达的影响 NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表达:梗死组较假手术组, AS-H+ML385组较AS-H组均显著降低(P<0.05);AS-L组、AS-M组、AS-H组较梗死组显著增加,呈现剂量依赖性(均P<0.05)。见图5。

图5 心肌组织NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表达比较

2.6 AS对各组大鼠心肌组织中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表达的影响 NRF2、GPX4、FPN1蛋白表达:梗死组较假手术组, AS-H+ML385组较AS-H组均显著降低(P<0.05);AS-L组、AS-M组、AS-H组较梗死组显著增加,呈现剂量依赖性(P<0.05)。见图6、表2。

图6 心肌组织中NRF2、GPX4、FPN蛋白表达(Western blot图)

表2 心肌组织中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表达的比较

3 讨论

心肌梗死严重威胁人们健康状况和生活质量,但对DM患者的威胁更大,是DM患者常见的并发症,且预后差,死亡率更高,且在全球范围内产生医疗费用较高,引起了人们的关注[10-11]。因此本研究通过高糖饲料及STZ建立DM大鼠模型,当血糖高于16.7 mmol/L时,并伴随三多症状(多食、多饮、多尿),则认为DM大鼠造模成功。将DM大鼠通过结扎左冠状动脉前降支,心电图显示ST段提高则表明DM心肌梗死大鼠模型构建成功,可进入下一步探究中。

AS是一种从柿子叶或绿茶种子中提取的黄酮类化合物,具有多种药理特性,包括抗炎、抗氧化和抗病毒以及对皮炎和神经元损伤的保护作用[12]。吴红伟等[13]研究发现AS具有保护心脏的作用。除此之外,在对心肌梗死大鼠的研究中,AS可改善大鼠心功能及心室重构[14-15]。本研究发现梗死组大鼠病理损伤严重,梗死体积比增加,心功能受损,提示DM心肌梗死大鼠心肌严重受损。但经AS-L、AS-M、AS-H干预后,大鼠心功能及病理损伤得到改善,梗死体积比减少,提示AS可保护DM心肌梗死大鼠心肌受损。

NRF2是一种应激诱导的转录因子,许多负责预防脂质过氧化以及由此引发的铁毒性的蛋白质和酶均是NRF2靶基因[16]。FPN1是一种铁运转氨酶哺乳动物中发现的一种重要的铁输出物,受铁水平的影响,其水平不足以维持铁过载细胞中的铁稳态,可导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过度循环产生,引发氧化应激损伤,导致铁死亡[17]。而铁死亡是一种新型的细胞死亡,与氧化应激密切相关,以产生ROS和脂质过氧化为特征,研究[18]表明,铁死亡是心肌梗死发展的关键机制。在谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)家族成员中,已知GPX4特异性催化脂质过氧化物的减少,从而清除脂质ROS,与铁死亡息息相关[19]。如柚皮素通过调节NRF2/GPX4轴抑制铁生死亡减轻心肌缺血/再灌注损伤[20]。本研究发现梗死组大鼠铁离子含量增加,NRF2、GPX4、FPN1 mRNA及蛋白表达降低,提示DM心肌梗死大鼠心肌受损可能通过抑制NRF2/FPN1通路发生铁死亡实现。但经AS-L、AS-M、AS-H干预后,NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表达上调,铁含量减少,推测AS可通过激活NRF2/FPN1信号通路保护DM心肌梗死大鼠心肌受损,可能和铁素相互作用,帮助蛋白质与药物结合,抑制铁死亡,以调节疾病的进展。为验证实验推测,以NRF2抑制剂-ML385回复验证,结果显示,AS-H+ML385组LVEF、NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表达显著降低,梗死体积比、铁离子含量、CK-MB、CK显著增加,推测AS-H可DM心肌梗死大鼠心肌受损,但由于NRF2/FPN1通路被ML385阻断,致使DM心肌梗死大鼠心肌受损,逆转了AS-H对DM心肌梗死大鼠的保护作用,进一步表明AS可通过激活NRF2/FPN1通路抑制铁死亡保护DM心肌梗死大鼠心肌受损。

4 结论

AS通过激活NRF2/FPN1通路抑制铁死亡,改善DM心肌梗死大鼠受损,为DM心肌梗死治疗提供依据,但由于机制复杂,后续需开展细胞实验进一步核实。