嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对斑马鱼胚胎及仔鱼的发育毒性

潘莉璇, 郭志芯, 毛连纲, 张 兰, 张燕宁,朱丽珍, 蒋红云, 刘新刚

(1.青岛农业大学 植物医学学院，山东 青岛 266109；2.中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193)

嘧菌酯(azoxystrobin)是全球开发成功的第一个甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，主要抑制线粒体的呼吸作用，破坏病原菌的能量合成[1]。目前嘧菌酯在全球范围内已得到广泛应用，根据中国农药信息网(http://www.icama.org.cn/)，查询嘧菌酯目前登记单剂(含原药) 282 个、混剂366 个，相比2019年单剂和混剂的登记数量均保持持续增长(截止日期：2023 年9 月11 日)[2]。随着嘧菌酯在全球农业生产中的大量应用，其在环境水体中的残留问题也日益突出，实际检出质量浓度在1～30 μg/L 之间[3-5]，因此其对生态环境的负面影响正逐渐受到关注。近年来有研究发现，嘧菌酯在农田施用后，会随着雨水冲刷和地表径流等途径进入水生生态系统，从而对鱼类等水生生物产生潜在威胁[6-7]。开展包括嘧菌酯对以斑马鱼为模式生物的水生生物的潜在环境风险评估研究是近年来的研究热点。高浓度嘧菌酯(1500 mg/L)暴露会导致斑马鱼胚胎畸形，如脊柱弯曲、心包水肿、尾部畸形等，并破坏线粒体的功能，甚至影响其生殖发育[8-10]；即使在环境浓度(20 μg/L)水平下，嘧菌酯也会对斑马鱼产生危害，比如受精后42 和60 d 斑马鱼雄鱼比例显著降低、雌雄同体比例升高[11]等。

富硒农产品富含人体和动物体所必需的微量元素硒(Se)，目前该类产品市场前景广阔、发展潜力大，正受到越来越多的关注[12]。硒代蛋氨酸(selenomethionine)作为一种有机硒，相比亚硒酸钠等无机硒更容易被生物体吸收利用，是替代无机硒的重要有机硒源[13-14]。目前在水稻等农作物生产上，主要采用叶面喷施硒代蛋氨酸等硒肥产品的方式来提高稻米等种植农产品中硒的含量[15]。然而，在农业生产上广泛应用的硒元素也是一把“双刃剑”——人和动物需要适量补充硒元素，但长期喷施过量硒也会对生态环境及人体健康产生不良影响[16]。何佳等检测发现，在我国8 大流域水体中，硒的实际检出质量浓度在0.10～7.39 μg/L之间[17]，其对生态环境的负面影响已逐渐受到关注。近年来有研究发现，超出营养安全剂量的硒元素随着生物富集，会对斑马鱼等水体生物产生致畸效应，甚至影响其发育和学习认知等行为[18-20]。

在我国水稻种植中，嘧菌酯一般在水稻分蘖末期用于预防水稻纹枯病[21]以及在水稻整个生育期内用于预防稻瘟病[22]，而硒肥一般在水稻齐穗期和抽穗期进行叶面喷施[23]。在稻田生态系统中，由于硒的有效利用率很低[24]，未被有效吸收利用的硒在农田环境中不断累积，会与嘧菌酯等农药形成复合暴露。关于嘧菌酯或硒对水生生物的单一毒性效应已有很多研究报道[8-10,18-20]，然而关于两者复合暴露毒性的研究很少。笔者等[16]前期评价了嘧菌酯与3 种常见外源性硒单剂(亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒)及其二元联合的混剂对斑马鱼不同生命阶段(成鱼、仔鱼和胚胎)的急性毒性，其中，斑马鱼不同生命阶段对硒代蛋氨酸的敏感性(以96h-LC50值，单位mg/L 表示，其中mg 指硒的质量)顺序依次为仔鱼(0.80 mg/L) > 胚胎(1.03 mg/L) > 成鱼(9.36 mg/L)；并通过相加指数法(AI)、毒性单位法(TU) 和混合毒性指数法(MTI)对其联合毒性效应进行了评价，结果发现，除MTI 法计算得到嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对成鱼的毒性效应表现为部分相加作用外，其余均为拮抗作用。

水生生物体在受到环境污染物危害时，会在体内产生及累积过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS) 而诱导氧化损伤，而过氧化氢酶(catalase，CAT) 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等可以清除体内多余的ROS，从而缓解氧化损伤[25]。线粒体呼吸链蛋白复合体 Ⅲ(简称线粒体复合体Ⅲ，即细胞色素c 还原酶)是线粒体中产生活性氧的主要部位，也是嘧菌酯的主要作用位点，其功能被抑制后可产生大量超氧负离子，从而可能引起心衰线粒体呼吸链异常并加剧活性氧的产生[26]。为进一步揭示嘧菌酯与硒复合暴露对斑马鱼的早期发育毒性，以及对氧化损伤的影响，本研究选取对斑马鱼胚胎急性毒性最高的硒代蛋氨酸，测定了嘧菌酯与硒复合暴露对斑马鱼胚胎的短期发育毒性以及相关酶(CAT、SOD)活性和线粒体复合体Ⅲ的影响，以期为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂与外源硒的科学及安全应用提供科学依据和数据支撑，从而有效平衡我国富硒产业发展和水稻田病害的高效防控。

1 材料与方法

1.1 供试生物与饲养条件

斑马鱼Danio rerio亲鱼：于国家斑马鱼资源中心(武汉)购买野生型AB 品系斑马鱼，在本实验室独立养殖系统(购自北京爱生科技发展有限公司)进行饲养繁殖。饲养用水(简称重组水)保持水温(26 ± 1) ℃，pH 7.0～7.5，电导率(500 ± 50) μS/cm。每天采用新鲜的丰年虾饲喂斑马鱼亲鱼3 次。保持光照/黑暗=14 h/10 h 循环。

试验用斑马鱼胚胎：挑选发育健康的10 月龄斑马鱼亲鱼成鱼，按雌/雄比例1 : 1 进行配对，并转移到有隔板的配鱼盒中，于第2 天开始光照后，移除隔板使之交配，收集受精后2 h (即2 hpf)的胚胎用于发育毒性试验。

1.2 主要仪器与试剂

Agilent 6470 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)以及Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm)(安捷伦科技有限公司)；AVIO200 型电感耦合等离子体发射光谱仪(珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)；SG68 多参数测试仪(梅特勒-托利多仪器有限公司)；YD300 便携式水质硬度仪(上海三信仪表厂)；BX63 奥林巴斯生物显微镜(奥林巴斯株式会社)；Infinite F50 多功能酶标测定仪(瑞士Tecan 公司)；酶活性检测试剂盒以及线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；98%嘧菌酯(azoxystrobin)原药(连云港市金囤农化有限公司)；9 8% 硒代蛋氨酸(selenomethionine) (北京百灵威科技有限公司)。

1.3 供试药剂浓度实测

1.3.1 混剂水样中嘧菌酯浓度实测 参照前期试验混合水样中嘧菌酯浓度实测分析方法[16]，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对本研究中嘧菌酯的初始浓度(0 h) 及换药液前浓度(24 h)进行取样实测。

1.3.2 混剂水样中总硒浓度实测 参照前期试验混合水样中总硒浓度实测分析方法[16]，采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)[27]对本研究中总硒的初始浓度(0 h)及换药液前浓度(24 h)进行取样实测。

1.4 斑马鱼胚胎及仔鱼发育毒性试验

1.4.1 复合暴露对斑马鱼胚胎及仔鱼的发育毒性试验 用适量丙酮配制60 mg/L 的嘧菌酯母液，用重组水配制150 mg/L (mg 指硒元素的质量，下同)的硒代蛋氨酸母液。参照前期测得嘧菌酯和硒代蛋氨酸单一成分对斑马鱼胚胎的急性毒性96 h-LC50结果0.52 和1.03 mg/L[28]，按等毒性配比(即两种药剂质量浓度比为1 : 2)方法，将斑马鱼胚胎分别暴露于嘧菌酯和硒代蛋氨酸4 个不同梯度二元混配(0.1 + 0.2、0.25 + 0.5、0.5 + 1.0 和1.0 +2.0 mg/L)复合暴露组中，同时设置空白对照(重组水)。同时根据前期研究[17]，为确保在整个试验周期内试验体系中嘧菌酯和硒代蛋氨酸的浓度和配比保持不变，试验药液每24 h 更换一次。将24 孔板转移到恒温培养箱中于(26 ± 1) ℃下培养，通过显微镜观察记录不同复合暴露组不同时间节点(24、48、72 和96 h) 胚胎的生长发育参数：自主运动、孵化数、心跳次数(20 s)、死亡率和体长等。判断胚胎孵化的标准是胎膜破裂，仔鱼成型，判断胚胎死亡的标准为显微镜下观察无心跳。

1.4.2 复合暴露对仔鱼酶活性及线粒体复合体Ⅲ活性的影响测定 同1.4.1 节，参照前期急性毒性96h-LC50结果，按等毒性配比法，将斑马鱼胚胎分别暴露于嘧菌酯和硒代蛋氨酸3 个不同梯度二元混配(0.0005 + 0.001、0.005 + 0.01 和0.05 +0.1 mg/L) 复合暴露组中，同时设置重组水空白对照。暴露结束后，将每个处理组的胚胎/孵化的仔鱼采用冰生理盐水冲洗多次并吸干水分，放入1.5 mL 离心管中，称量后按1 : 9 加入生理盐水进行匀浆并低温冷冻离心10 min (3500 r/min)，取上清液于 –80 ℃保存，待测。采用考马斯亮蓝法，分别按照CAT、SOD 以及线粒体复合体Ⅲ相关试剂盒操作说明，采用微孔酶标仪测定吸光值，并利用试剂盒方法计算活力值。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0 进行数据分析，通过单因素方差分析差异显著性分析(P< 0.05，表示数据之间差异显著；P< 0.01，表示数据之间差异极显著)。

2 结果与分析

2.1 体系中嘧菌酯与硒代蛋氨酸的实测质量浓度

测定结果(表1)表明，嘧菌酯与硒代蛋氨酸所有复合暴露处理组水样中0 h 和24 h 的实测质量浓度与理论质量浓度比值均满足80%～120%的要求，表明嘧菌酯与硒代蛋氨酸在24 h 内基本稳定，即本研究中通过每24 h 更换一次试验药液，可以确保整个试验周期内嘧菌酯和硒代蛋氨酸药剂浓度和配比保持基本不变，从而设定理论质量浓度可以代替实测值直接用于相关毒性数据分析。

表1 二元混剂对斑马鱼胚胎发育毒性试验中药剂质量浓度测定Table 1 Determination of concentrations in developmental toxicity test of binary mixtures on zebrafish embryo

2.2 嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对胚胎自主运动的影响

结果如图1 所示，在受精后24 h (即24 hpf，其余同) 时，对照组斑马鱼胚胎20 s 内的自主运动次数为1.8 次，而嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露处理组均显著抑制了斑马鱼胚胎的自主运动(P< 0.05)，其中，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最低浓度复合暴露组(0.1 + 0.2 mg/L)胚胎20 s 内的自主运动次数下降为1.1 次，其余3 个更高浓度组抑制作用更加明显，胚胎20 s 内的自主运动次数均出现大幅降低，仅为0.8 次左右。

图1 嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露对斑马鱼胚胎自主运动的影响Fig.1 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on autonomic movement

2.3 嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对胚胎孵化率及死亡率的影响

如图2-A 所示，与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露处理均显著抑制了胚胎的孵化。48 hpf 时，对照组斑马鱼胚胎孵化率达到23.3%，而高浓度复合暴露处理组(1.0 +2.0 mg/L)则完全未孵化；60 hpf 时，对照组胚胎孵化率达63.3%，而不同浓度复合暴露组胚胎孵化率均显著低于对照组，且各处理组之间均存在显著差异(P< 0.05)，其中，高浓度复合暴露处理组(1.0 + 2.0 mg/L)孵化率最低，仅8.33%；72 hpf和96 hpf 时，对照组胚胎孵化率达100%，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最低浓度复合暴露组(0.1 + 0.2 mg/L)的胚胎孵化率达到93.3%，与空白对照组相比其抑制作用已逐渐消除，但其余3 个更高浓度复合暴露组的胚胎孵化率最高仅73.3%，仍表现出明显的抑制作用(P< 0.05)。

图2 嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露对斑马鱼胚胎孵化率和死亡率的影响Fig.2 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on hatching rate and mortality

从图2-B 中可看出，与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最低浓度复合暴露处理(0.1 +0.2 mg/L) 对胚胎的死亡率无显著影响，但其余3 个更高浓度复合暴露组胚胎的死亡率均出现明显升高(P< 0.05)，其中，96 hpf 时，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最高浓度复合暴露组(1.0 + 2.0 mg/L)斑马鱼胚胎的死亡率高达90.0%，远高于其余各处理组(P< 0.01)。

2.4 嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对仔鱼心跳及体长的影响

如图3-A 所示，在48 hpf 和72 hpf 时，对照组斑马鱼胚胎在20 s 内的心跳次数分别达到44.5次和49.2 次，而嘧菌酯与硒代蛋氨酸除最高浓度复合暴露组(1.0 + 2.0 mg/L)显著抑制了斑马鱼胚胎的心跳外，其余各浓度复合暴露组与空白对照组相比均无显著差异；随受精后时间延长，复合暴露组对斑马鱼胚胎心跳的抑制作用更加明显，96 hpf 时，除最低浓度复合暴露组(0.1 + 0.2 mg/L)外，其余3 个更高浓度组均显著抑制了胚胎的心跳，其中最高浓度复合暴露组(1.0 + 2.0 mg/L)抑制作用最为显著，20 s 内的胚胎心跳仅33.5 次。

图3 嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露对斑马鱼仔鱼心率和体长的影响Fig.3 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on heart rate and body length

从图3-B 中可看出，72 hpf 时，对照组斑马鱼胚胎体长达3690.7 µm，而嘧菌酯与硒代蛋氨酸除最高浓度复合暴露组(1.0 + 2.0 mg/L) 显著抑制了斑马鱼的生长(P< 0.05)外，其余各浓度复合暴露组斑马鱼体长与空白对照组相比均无显著差异；随受精后时间延长，复合暴露组对斑马鱼体长的抑制作用更加明显，96 hpf 时，复合暴露各浓度组均显著抑制了斑马鱼的生长，其中最高浓度(1.0 + 2.0 mg/L) 抑制作用最为显著，体长仅3277.3 µm (P< 0.05)。

2.5 嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对仔鱼抗氧化酶和线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性的影响

如图4-A 所示，与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸3 个浓度复合暴露组均显著抑制了斑马鱼仔鱼体内CAT 活性(P< 0.05)，且药剂浓度越高，抑制作用越明显。其中，嘧菌酯与硒代蛋氨酸中浓度(0.005 + 0.01 mg/L)和低浓度(0.0005+ 0.001 mg/L)复合暴露组仔鱼体内CAT 活性差异不显著，但最高浓度复合暴露组(0.05 + 0.1 mg/L)仔鱼体内CAT 活性均显著低于中浓度和低浓度组。但与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸3 个浓度复合暴露组对仔鱼体内SOD 活性则均无显著影响(P> 0.05) (图4-B)。

图4 嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露对斑马鱼仔鱼过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性的影响Fig.4 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and mitochondrial complex III activity

从图4-C 中可看出，与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最高浓度复合暴露组(0.05 +0.1 mg/L)显著抑制了仔鱼体内线粒体呼吸链复合体Ⅲ的活性(P< 0.05)，但中浓度(0.005 + 0.01 mg/L)和低浓度复合暴露组(0.0005 + 0.001 mg/L)仔鱼体内线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性差异不显著(P> 0.05)。

3 结论与讨论

与空白对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露处理组均显著抑制了斑马鱼胚胎的自主运动次数和胚胎孵化率(P< 0.05)。其中，最低浓度复合暴露处理组(0.1 + 0.2 mg/L)对胚胎孵化率的抑制作用在72 hpf 后可恢复正常，且对胚胎死亡率、心跳等均无显著影响，但其余3 个更高浓度复合暴露组胚胎的死亡率均出现明显升高(P< 0.05)。说明嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露对斑马鱼胚胎及仔鱼自主运动、孵化率、死亡率、心跳等的影响存在明显的剂量效应关系。此外，72 hpf 时，除最高浓度复合暴露组(1.0 + 2.0 mg/L)显著抑制了斑马鱼的生长外，其余各浓度复合暴露组斑马鱼体长与空白对照组相比均无显著差异；但96 hpf 时，所有浓度复合暴露组均显著抑制了斑马鱼的生长(P< 0.05)，其中最高浓度组(1.0 +2.0 mg/L)抑制作用最为显著。说明相比斑马鱼胚胎及仔鱼的孵化率、死亡率及心跳等指标，胚胎的自主运动次数和体长指标更为敏感，更容易受到嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露的影响。

根据现有文献报道，嘧菌酯在实际自然水体环境中的检出质量浓度范围为1～30 μg/L[3-5]，硒在我国流域水体中的检出质量浓度范围为0.10～7.39 μg/L[17]，而基于本研究结果，斑马鱼胚胎及仔鱼的96 hpf 孵化率、死亡率及心跳等指标尚不会受到自然水体环境中嘧菌酯与硒代蛋氨酸复合暴露的影响。

此外，本研究表明，嘧菌酯与硒代蛋氨酸3 个浓度复合暴露组均显著抑制了仔鱼体内CAT活性(P< 0.05)，且药剂浓度越高，CAT 活性受抑制作用越明显；但所有浓度复合暴露组仔鱼体内超SOD 活性却均无显著变化(P> 0.05)。说明CAT对两种药剂的复合暴露更为敏感，即使是最低浓度暴露组 (0.0005 + 0.001 mg/L)，即在自然水体环境中嘧菌酯及硒的实际检出浓度水平下，也会受到二者复合暴露的显著影响。而本团队之前的研究发现，在嘧菌酯低质量浓度(0.00025 和0.0025 mg/L)暴露下，斑马鱼仔鱼体内CAT 活性并不会出现显著变化[9]，说明低浓度的硒代蛋氨酸(0.001 mg/L)，即在自然水体环境中硒的实际检出浓度水平下，复合暴露后可能会加重嘧菌酯对斑马鱼仔鱼的氧化胁迫。与对照组相比，嘧菌酯与硒代蛋氨酸最高浓度复合暴露组(0.05 + 0.1 mg/L)显著抑制了仔鱼体内线粒体呼吸链复合体Ⅲ的活性(P< 0.05)，但中浓度(0.005 + 0.01 mg/L)和低浓度(0.0005 +0.001 mg/L)复合暴露组，即在自然水体环境中嘧菌酯及硒的实际检出浓度水平下，仔鱼线粒体复合体Ⅲ的活性差异并不显著。心肌细胞和神经元是两个高能量需求位点，易受线粒体损伤的影响，线粒体功能障碍与胚胎的心脏毒性和神经毒性有关，而本研究发现，嘧菌酯与硒代蛋氨酸低浓度复合暴露处理(0.1 + 0.2 mg/L) 对斑马鱼胚胎心跳并未表现出显著影响，说明线粒体复合体Ⅲ活性是更为敏感的指标，可以考虑将其作为潜在的敏感生物标志物，用于嘧菌酯与硒代蛋氨酸的复合暴露监测。

综上所述，本研究中嘧菌酯与硒代蛋氨酸不同浓度复合暴露后会对斑马鱼胚胎及仔鱼发育产生毒性效应，但在目前自然水体环境中嘧菌酯及硒的实际检出浓度水平下，除了会抑制仔鱼体内CAT 活性外，尚不会影响胚胎的自主运动次数、孵化率、死亡率、心率以及仔鱼体长等指标，也不会影响仔鱼体内SOD 活性和线粒体复合体Ⅲ的活性。所得研究结果可以为水体环境中嘧菌酯和硒代蛋氨酸浓度监测及复合暴露的生态风险评估提供数据支撑，从而有助于平衡我国富硒产业发展和水稻田病害的高效防控。