基于磁固相萃取-便携式离子阱质谱的蔬菜中3 种农药残留的快速检测

陈庭男, 齐沛沛, 华修德, 王鸣华, 何 吉,闻路红, 章文天, 王新全*,

(1.南京农业大学 植物保护学院，南京 210095；2.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，杭州 310021；3.宁波华仪宁创智能科技有限公司，浙江 宁波 315100)

0 引言

因农药超范围、超量使用导致的农产品中农药残留超标，成为我国近年来面临的较为突出的农产品安全问题。2021 年，农业农村部等七部委联合颁布“三年行动”方案，明确指出要严格市场准入管理，并提出精准治理理念，蔬菜方面重点治理“三颗菜”——芹菜、韭菜、豇豆中易超标和禁限用农药[1]。为了及时、有效地监测农产品中农药残留，确保进入市场的农产品安全性，迫切需要研发现场、多农药同时测定的定性/半定量快检创新技术。

质谱以精准的定性能力成为近年来实验室分析的强力支撑。随着质谱微型化以及直接电离质谱等技术的飞速发展，如原位实时直接分析(DART)[2]、解吸电喷雾离子源 (DESI)[3]、介质阻挡放电 (DBDI)[4-5]和脉冲式电喷雾离子化技术[6]，推动了便携式质谱技术走向现场快速检测中，在公共安全、环境监测、食品安全、生物科学等领域均有应用[7-13]。

然而，样品不经色谱分离，直接电离进入质谱，极易导致样品中杂质离子共流出，引起显著的离子抑制或增强，严重影响检测结果的正确度和灵敏度。因此，亟需建立快捷、高效、可以匹配于便携质谱仪分析的前处理技术。磁固相萃取技术 (MSPE) 是以磁性功能材料为吸附剂，兼具固相萃取高效富集功能和磁材料传质效率高、分离速度快的优势，且无需辅助设备，非常适于现场快速预处理。Liu 等[14]以亲脂性二乙烯基苯和亲水性吡咯烷酮为功能单体，在Fe3O4颗粒表面聚合，研制出亲疏水平衡型磁材料磁性聚(二乙烯基苯-吡咯烷酮，PLS)，建立了可同时富集海水中96 种农药多残留的分析方法。Lin 等[15]将单体2,5-二羟基对苯二甲醛和1,3,5-三 (4-氨基苯基) 苯接枝到磁性纳米颗粒表面上，制备磁性共价有机框架 (COF)，建立了高效MSPE方法，用于水果中有机磷农药的测定。Wang 等[16]以L-丙氨酸修饰的MIL-88B 为原料，制备了磁性金属有机框架(MOF)，建立了MSPE 方法用于蔬菜中新烟碱类农药的测定。这些研究为快速样品前处理技术提供了新材料和选择，然而目前仍主要与色谱-质谱联用分析多农药残留，尚未见与便携式离子阱质谱仪联用进行农药残留分析的研究报道。

综上，本研究拟以“三颗菜”中易超标农药啶虫脒、吡虫啉和禁限用农药克百威为研究对象，以普适性PLS 磁珠为吸附剂，开展快速样品前处理，结合直接电离-便携式离子阱质谱仪，建立“三颗菜”中多农药残留、现场快速检测技术，为蔬菜中多农药残留的同时、准确、快速筛查分析提供新的技术，旨在为区县监管机构的市场抽检、大型商超及批发市场的产品质控等提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CRAIV-110 便携式质谱仪 (宁波华仪宁创智能科技有限公司)；毛细管探针 (武汉微探生物科技有限公司)；LC-8050 液相色谱仪 (LC，日本Shimadzu 公司)；SCIEX 4500 三重四极杆质谱联用仪 (美国Sciex 公司)；Biofuge Primo R 台式离心机 (美国Thermo 公司)；Filter Unit 滤膜 (0.22 μm，天津Agela Technologies公司)。

亲疏水平衡型磁材料PLS 为实验室自制[14]。试验用水为超纯水 (Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司)；甲醇和乙腈 (色谱纯 美国Merck公司)；甲酸 (美国ACS 公司)。啶虫脒 (acetamiprid)、吡虫啉 (imidacloprid) 和克百威 (carbofuran) 标准品，均购于农业农村部环境保护科研监测所。蔬菜样品购于杭州各大农贸市场。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 溶剂萃取过程 (水萃取过程)：称取匀浆后的蔬菜样品 (2.00 ± 0.02) g 于50 mL 离心管中，加入20 mL 水，涡旋5 min，于5000 r/min 下离心1 min，取上清液，备用。

磁固相萃取过程：准确称取30 mg PLS 磁珠于2 mL 离心管中，加入2 mL 甲醇，活化1 min后弃甲醇，加入上清液中，超声萃取 (磁珠萃取)15 min，用磁力枪将磁性材料取出；加入到4 mL体积分数为0.1%的甲酸乙腈中，涡旋洗脱3 min，在外加磁场作用下取上清液，过0.22 μm 滤膜；用探针蘸取滤液，蘸取时间不少于3 s，待便携式质谱仪分析。

1.2.2 仪器检测条件 探针为石英玻璃毛细管：外径为1.5 mm，内径为1.1 mm，长度为5 cm；探针针尖口径：50 μm；探针针尖到质谱仪入口距离：10 mm。便携式质谱仪采样毛细管：内径为0.37 mm，长度为100 mm，直流电压90 V；探针式离子源离子源极性：正离子模式 (ESI+)；打拿极电压-5500 V；倍增器电压-1050 V；线性离子阱：共振交流电的电压为1～4 V，射频幅值电压为120～1500 V；MS2分析质谱参数见表1。

表1 各农药的MS2 分析参数Table 1 MS2 analysis parameters for each pesticide

1.2.3 标准溶液的配制及标准曲线绘制

储备液的制备：用甲醇溶解各农药标准品，配制成质量浓度为16 mg/L 的单一标准储备液。

混合标准品溶液：分别准确移取定量储备液于25 mL 容量瓶中，混匀，用甲醇稀释，配制成质量浓度为2 mg/L 的混合标准品溶液。

基质匹配标准品溶液：用空白样品提取液稀释混合标准品溶液，配制成0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 和0.5 mg/L 系列质量浓度的基质匹配标准品溶液。根据需要，现配现用。

配制0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 和0.5 mg/L 系列质量浓度的标准溶液和基质匹配标准溶液，每个水平重复5 次，每次检测更换不同的探针，以化合物质量浓度为横坐标 (x)，便携式质谱仪中目标物的离子强度响应值为纵坐标 (y) 绘制标准曲线。

1.2.4 方法对比验证 将本研究所建立的方法和传统实验室分析方法液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)[17]进行结果比对，验证该方法的可行性。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法建立

前处理方法优化过程中，以芹菜作为代表基质，各农药的混配质量分数均为0.2 mg/kg，采用单因素评价方法，重点考察萃取溶剂、磁固相萃取中磁吸附剂用量、吸附时间、解吸溶剂及体积等主要因素对各农药离子信号强度的影响，筛选最佳优化参数。样品前处理流程示意图如图1所示。

图1 样品前处理流程图Fig.1 Sample pre-treatment flow chart

2.1.1 萃取溶剂及体积对农药回收率的影响 对比了纯水、乙腈和缓冲盐溶液作为萃取溶剂的萃取效率差异 (添加的目标农药均经过24 h 隔天处理)。将萃取液直接采用LC-MS/MS 分析[17]，结果(表2) 显示，纯水作为提取溶剂对目标农药提取率均高于90%，效果优于缓冲盐溶液 (组成成分为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和水)。同时发现缓冲盐溶液会明显抑制离子信号，故选择纯水进行匀浆蔬菜样品中农药残留的萃取。在此基础上考察了纯水用量 (10、20 和30 mL) 对农药提取效果的影响，结果如图2 所示。当纯水用量从10 mL到20 mL 时，目标农药的离子信号强度呈上升趋势，分别在130～230 和240～280 之间。当继续增加到30 mL 时，农药的离子信号强度为245～280，与20 mL 处理相比，提取效果提升并不显著。因此，选用20 mL 纯水作为萃取溶剂。

图2 纯水用量对3 种农药离子信号强度的影响Fig.2 Eeffect of amount of pure water on the ions signal of three pesticides

表2 萃取溶剂对3 种农药提取效果的影响Table 2 Eeffect on extraction of target pesticides with different extraction reagents

2.1.2 磁固相萃取方法建立

2.1.2.1 PLS 用量 首先，考察了磁固相吸附剂PLS 用量 (10、20、30、40 mg) 对各农药提取效果的影响。结果 (图3) 发现，当PLS 用量在10～30 mg 之间时，目标农药的信号强度总体呈上升趋势，分别为210～302、212～320 和255～345。当继续增加磁材料用量到40 mg 时，信号强度为240～335，相较于30 mg 无明显提升。综合考虑，吸附材料PLS 的用量为30 mg。

图3 不同磁性材料PLS 用量条件下各3 种农药的离子信号强度Fig.3 The ions signal of three pesticides using different amounts of magnetic material PLS

2.1.2.2 PLS 吸附时间 在确定了PLS 用量为30 mg的基础上，采用超声辅助吸附，考察了吸附时间(10、15、20 min) 对农药提取效果的影响，如图4所示，当吸附时间为10、15、20 min 时，目标农药的信号强度分别为195～236、266～295 和269～291。在10～15 min 范围内，农药的离子信号强度呈上升趋势，继续增加时间至20 min，趋于稳定。因此，选择超声吸附时间为15 min。

图4 吸附时间对3 种农药离子信号强度的影响Fig.4 Effect of adsorption time on the ions signal of threepesticides

2.1.2.3 解吸附溶剂 合适的解吸附溶剂是影响洗脱的一个重要因素。在本研究中，选择8 种解吸附剂，考察其对3 种农药的洗脱能力，包括甲醇溶液、乙腈溶液、体积分数 (下同) 为0.1%的甲酸乙腈(ACN-0.1%FA)、0.1%甲酸甲醇(ME-0.1%FA)、0.2%甲酸乙腈(ACN-0.2%FA)、0.2%甲酸甲醇(ME-0.2%FA)、0.5%甲酸乙腈(ACN-0.5%FA)和0.5%甲酸甲醇(ME-0.5%FA)。如图5 所示，乙腈的洗脱效果优于甲醇，且用体积分数0.1%甲酸酸化的乙腈效果更好，0.1%甲酸的加入进一步提高了解吸附剂的洗脱能力。因此，选用0.1%甲酸乙腈作为解吸附溶剂。

图5 解吸附溶剂对3 种农药离子信号强度的影响Fig.5 The ions signal of three pesticides using different kinds of desorption solvents

2.1.2.4 解吸附溶剂体积 解吸附溶剂体积也是获得准确和稳定结果的关键因素。本研究中，考察了不同体积的0.1%甲酸乙腈 (3、4、5 mL) 对3种农药提取效果的影响，如图6 所示，当0.1%甲酸乙腈体积为4 mL 时，3 种农药的离子信号最强。综合考虑，选择4 mL 0.1%甲酸乙腈作为解吸附溶剂。

图6 0.1%甲酸乙腈体积对3 种农药离子信号强度的影响Fig.6 The ions signal of three pesticides using different volumes of acetonitrile with 0.1% (V/V) formic acid

2.1.2.5 0.1%甲酸乙腈解吸时间 研究了解吸时间 (1、3 和5 min) 对3 种农药提取效果的影响，如图7 所示，解吸时间为3 min时目标农药的离子信号强度较解吸时间为1 min有显著提高，整体呈上升趋势。当解吸时间继续增加到5 min 时，离子信号强度趋于稳定。考虑到时间越长，杂质伴随目标物洗脱的可能性越大，因此解吸时间以3 min 最佳。

图7 解吸附时间对3 种农药离子信号强度的影响Fig.7 Effect of desorption times on the ions signal of three pesticides

2.2 方法验证

通过评估其线性、灵敏度、回收率、精密度，验证所开发方法的性能及适用性。

2.2.1 线性范围及灵敏度 结果如表3 所示，3 种农药在芹菜、韭菜、豇豆中均具有较好的线性关系，线性范围随基质的差异略有不同。除啶虫脒的相关系数 (r=0.9880) 外，其余各农药的r均大于0.99。然而，便携质谱仪缺少色谱的分离功能，样品中杂质离子的共流出带来了严重的离子竞争抑制，因此存在普遍的基质效应，需采用基质匹配标准溶液进行定量分析。质谱的定性能力强、准确性好，作为定性/半定量的检测方法，能够满足日常工作中的快速筛选。

表3 三种农药的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限Table 3 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, LODs and mLOQs for three pesticides

3 种农药在芹菜、韭菜、豇豆基质中的的检出限 (LOD) 在0.001～0.035 mg/L 之间，方法定量限(mLOQ) 在0.02～0.05 mg/kg 之间，均低于GB 2763—2021 中规定的最大残留限量 (MRL)[18]，表明该前处理方法与仪器检测平台联用具有优良的检测能力和合规性。

2.2.2 正确度及精密度 使用空白样品进行添加回收试验，添加水平为0.02、0.05、0.2 mg/kg，每个水平重复5 次，采用定量离子响应强度计算回收率和RSD，结果见表4。在0.02～0.2 mg/kg添加水平下，各目标农药的回收率在50%～71%，相对标准偏差为4.2%～22%。表明该前处理方法联用便携质谱形成的农残快检技术，具有较好的灵敏度和准确性，适用于芹菜、韭菜、豇豆中的农药残留快速检测。

表4 3 种农药在芹菜、韭菜、豇豆中的添加回收率及相对标准偏差Table 4 Recoveries and RSDs of the three pesticides in celery, Chinese chives and cowpea samples

2.3 实际样品分析

利用本研究建立的分析方法，对购自杭州各大农贸市场的100 个蔬菜样品 (芹菜、韭菜和豇豆) 进行农药残留分析，并与传统的实验室分析结果进行比对，验证该方法在农药残留检测中的稳定性与可行性，结果如表5 所示。100 份样品中有6 份检出目标农药，检出量为0.021～0.58 mg/kg，且本方法分析结果与传统实验室分析结果一致性较高，满足国家标准中对最大残留限量分析的要求，未出现假阳性或假阴性情况，表明本方法具有较强的定性准确度，且本方法可以对目标物进行半定量分析，检测结果更加准确。与传统分析方法不同的是，1) 便携式质谱仪器的分析时间仅需20 s，极大缩短了检测过程所需的时间。2) 具有可现场操作的便捷性。3) 具有更强的抗干扰能力，能够适用多种复杂基质，满足目标物的多基质检测。综上，该方法能够满足芹菜、韭菜、豇豆中多种农药残留的现场、快速同时检测。

表5 实际样品中3 种农药残留的测定结果Table 5 The pesticide residues of three pesticides in real samples

综上所示，本研究所建立的农药残留速测技术具有较强的定性、半定量能力，与实验室精准分析仪器一致性较高，在实际样品的检测中未出现假阳性及假阴性情况，且能够满足多种基质中多目标物的同时检测，检测时间短，检测成本低。

2.4 基质适用性评价

基质适用性是评价方法适用性的一个重要指标。本研究以豇豆为例，分别选取了3 个不同品种的豇豆样品 (豇豆1、豇豆2、豇豆3) 进行了基质适用性评价。分别配制0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/L 系列质量浓度的标准溶液和基质匹配标准溶液，每个水平重复5 次，且每次更换不同的探针，以化合物质量浓度为横坐标 (x)，对应目标物的离子强度响应值为纵坐标 (y) 绘制标准曲线，结果如表6 所示。从结果来看，豇豆基质中3 种目标农药的基质效应在0.085～0.16 之间，主要原因为仪器缺乏色谱的分离功能，杂质对目标农药干扰严重，导致实际离子信号强度偏弱，但3 种农药基质效应的相对标准偏差均低于15%，表明同类蔬菜所造成的基质效应相似。在检测过程无法获得空白基质的情况下，可提前准备同类蔬菜样品，以满足日常检测，进一步提升该方法的适用性。

表6 不同品种豇豆的基质效应评价Table 6 Matrix effects of different kinds of cowpea

3 结论与展望

本研究优化了溶剂萃取-磁性固相萃取净化前处理技术，结合直接电离-便携式离子阱质谱仪，构建了芹菜、韭菜和豇豆中啶虫脒、吡虫啉、克百威残留的快速检测技术。3 种目标农药在芹菜、韭菜、豇豆中均具有较好的线性关系，相关系数(r) 除啶虫脒 (r=0.9880) 外均大于0.99。检出限为0.001～0.035 mg/L，定量限为0.02～0.05 mg/kg，均低于GB 2763—2021 中规定的最大残留限量，表明该前处理方法与仪器检测平台联用具有优良的检测能力。实际样品分析结果表明，本方法未出现假阳性或假阴性情况，展现出较强的定性准确度。本方法能够同时适用于多种复杂基质中多个目标物的同时检测，检测时间短、操作简便。综上所述，该技术准确性较好、定性/半定量能力强、可现场快速筛查，实现现场多目标定性检测，为区县监管机构的市场抽检、大型商超及批发市场的产品质控等提供技术支撑。

目前，基于便携式质谱展开的农药残留现场速测技术尚处于起步研究阶段，由于仪器端缺乏色谱的分离功能，导致杂质与目标农药共流出，基质干扰十分严重，目标农药回收率无法达到70%～120%的分析要求。后续需要进一步提高仪器的检测灵敏度，提高对目标物的检出能力。同时要进一步优化样品前处理技术，后续仍需进一步探究净化除杂的可行性，深入研究不同样品前处理技术的净化能力和操作效率，构建出更适合于现场快速检测的新技术与产品。