自噬流调控在白内障眼病中的研究进展

王从玉,李鹏飞,王思文,鲍思洁,石海红,管怀进

0 引言

白内障是全球致盲性眼病的主要原因,表现为晶状体透明度丧失,严重影响患者的视力[1]。而手术干预是目前治疗白内障唯一有效的治疗方法。因此,探讨白内障的发病机制就显得尤为重要。白内障的病因较为复杂,包括基因突变引起的晶状体先天发育异常、衰老引起的氧化损伤、糖尿病引起的糖代谢异常以及术后炎症因子刺激导致晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)增生等因素,都与白内障的形成有关。近年来,越来越多的研究发现自噬流的调控可通过改变LECs的状态,参与白内障的病理生理过程。因此,为了系统地了解自噬流调控对白内障眼病的影响,本文对其展开综述。

1 自噬流及其调控通路

1.1自噬流细胞自噬是一系列自噬膜结构逐渐成熟的动态过程。目前将自噬双层膜形成、自噬体形成、自噬溶酶体形成以及自噬溶酶体降解的动态过程定义为自噬流(autophagic flux),亦称为“自噬潮”[2]。主要包括:(1)自噬起始:含Atg1/ULK1的复合物启动自噬。(2)自噬体形成:Beclin1/Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ)复合物、Atg9-Atg2-Atg18复合物和Atg5-Atg12-Atg16L1复合物、以及依赖于Atg3、Atg4和Atg7的LC3,介导自噬体的延长和成熟[3-4]。(3)自噬体和溶酶体的运输和融合:此过程需要Rab7[5-6],EPG5[6-7],HOPS[8-9],PLEKHM1[10]和SNAREs的参与[11-12]。(4)自噬完成:此过程需要溶酶体内的水解酶降解自噬体,并通过转运体将降解产物释放到细胞质中,重新合成新的生物大分子或参与其他代谢途径[13-14]。

1.2调控自噬流的信号通路mTOR通路是目前白内障自噬流调控通路研究最多的一条通路,它是多条信号通路的汇聚点,如下所示:(1)PI3K-AKT-mTOR信号通路:PI3K激活的结果是活化AKT,AKT磷酸化mTOR分子并激活mTOR,进而抑制自噬,或通过磷酸化TSC1/2,阻止其对小G蛋白Rheb的负调控,进而使Rheb累积,而后上调mTOR,抑制自噬启动。(2)AMPK-mTOR信号通路:生理状态下,细胞内AMPK处于失活状态,环境刺激因素,如缺氧、饥饿等可引起细胞内能量降低,导致AMP/ATP的比值增高,从而激活AMPK;当细胞内能量下降时,LKB1可磷酸化激活AMPK,活化的AMPK通过抑制mTORC1的活性,进而诱导自噬。AMPK/mTOR/ULK1通路作为调控自噬的重要路径而备受关注,在营养缺乏时,激活的AMPK通过抑制mTOR,来催化ULK1磷酸化从而激活自噬,是一种正向调控机制;相反,在营养充足时,PI3K-AKT活化下游的mTOR磷酸化ULK1,抑制自噬。(3)MAPK信号通路:包括ERK、JNK和p38激酶家族通路,在许多细胞活动中起作用,如生长增殖、细胞分化、细胞运动或死亡。在这一过程中改变自噬信号通路会影响自噬进程,参与白内障的发生[15]。

2 自噬流调控在白内障眼病中的作用机制

2.1先天性白内障先天性白内障(congenital cataract,CC)的发生机制:晶状体主要由未分化的单层立方上皮细胞以及其分化而来的纤维细胞组成,在上皮细胞分化为成熟的纤维细胞过程中会伴随着线粒体和内质网等膜性细胞器的降解,形成无细胞器区(organell-free-zone, OFZ),细胞器的异常降解会导致晶状体细胞发育异常,影响其透明度,从而引发CC的形成[16]。而自噬不仅能回收利用LECs中受损细胞器和错误折叠蛋白,而且在LECs分化成晶状体纤维细胞过程中参与细胞器的降解中同样发挥重要作用[17]。

目前,研究显示存在FYCO1、Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(Pik3c3)、CHMP4B、EPG5、ERCC6、TDRD7等基因的突变/敲除,通过影响自噬流的运行,导致CC的形成。FYCO1基因突变是导致常染色体隐性遗传性CC的原因之一,其主要通过抑制自噬体向溶酶体转运过程,导致晶状体纤维细胞中细胞器降解失败,从而使晶状体发生混浊,形成CC[18]。Pik3c3又称为Vps34,是唯一一个Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ),有学者研究发现在特异性敲除Pik3c3的鼠模型中,自噬流的发生在胚胎时期即受到抑制[17]。CHMP4B是3个人类直系同源的哺乳动物Vps32基因之一,其在常染色体显性遗传性CC患者中发生基因突变,进而调控自噬流的降解过程参与白内障的形成[19]。EPG5是特异性自噬基因epg-5的人类同系物,编码一个关键的自噬降解阶段的调节因子(异位P颗粒自噬蛋白5),与自噬溶酶体的形成有关。已有研究证实EPG5基因突变在Vici综合征中具有致病作用,而Vici综合征是一种隐形遗传性多系统疾病,可表现为CC[20]。Cockayne综合征是因ERCC6或ERCC8基因突变所导致的遗传性疾病,多伴发CC,而ERCC6是DNA修复机制核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)的重要成员,因此,其表达的缺失与CC的形成密切相关。近来,有学者发现,ERCC6与溶酶体膜蛋白VCP存在相互作用,进而影响自噬体与溶酶体的结合而导致LECs内自噬流的降解异常。所以,ERCC6在CC中也可能通过调节自噬流的降解阶段来参与白内障的形成过程,但其在CC中具体的作用机制有待进一步探索[21]。此外,最近的一项研究发现在CC患者中存在TDRD7基因突变,TDRD7在眼组织中大量表达[22]。进一步研究发现,TDRD7可能直接与自噬关键调节因子Tbc1d20 mRNA结合并下调其表达,抑制自噬体和溶酶体的融合,从而破坏自噬流,导致晶状体纤维细胞中错误折叠蛋白质和受损细胞器的降解异常,进而导致人和小鼠晶状体发育异常[23]。

晶状体结构蛋白对维持晶状体透明度的重要性不言而喻,所以编码晶状体蛋白的基因点突变可导致CC形成。研究证实晶状体缝隙连接蛋白α(Gja8b)基因突变会导致斑马鱼LECs中细胞器降解功能障碍,通过诱导自噬下调可能是导致CC发生的主要致病机制[24]。α晶状体蛋白是晶状体内重要的伴侣蛋白,是两种多肽αA-和αB-晶状体蛋白的低聚物,其分子伴侣活性使其在维持晶状体的透明过程中发挥重要的作用。Wignes等[25]研究发现αB-晶状体蛋白R120G(aBR120G)突变小鼠LECs中持续存在错误折叠的蛋白质聚集体,表明自噬清除功能受损,p62蛋白累积,最终导致CC形成。同样,αA-R49C突变导致LECs中p62累积,蛋白质聚集,细胞死亡以及突变蛋白质在细胞核中错误定位,而增强自噬可促进LECs中蛋白质降解,从而减少晶状体混浊,提示自噬缺陷与CC的致病机制相关[26],通过激活自噬流来防止晶状体中蛋白质聚集的研究,将为后续揭示CC的发病机制提供明确方向。

2.2年龄相关性白内障年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)形成的确切发病机制尚未完全阐明[27]。自噬流调控LECs的凋亡是近年来研究的热点话题,多项研究结果表明自噬流的增强或通畅可以减少LECs的凋亡,延缓ARC的发生发展。已有学者证实,晶状体组织中自噬流起始阶段的关键蛋白Atg5和Atg4a缺失导致自噬流起始阶段异常,从而加速LECs的凋亡,最终导致小鼠ARC的发生[17,28]。此外,还有学者发现自噬溶酶体降解通路降解错误折叠的氧化损伤修复蛋白MSH3和XRCC5,进而调控LECs的凋亡,参与ARC的发生发展[29-30]。

近年来多项研究证实,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在ARC的自噬流过程中发挥重要的调控作用。ncRNA可以通过多种机制参与调控靶基因信使RNA(mRNA)的表达而得以广泛运用,主要包括微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)。许多研究探索发现miRNA通过调控自噬流的靶基因来参与ARC的发生发展[31]。研究发现,miR-23b-3p在LECs中显著上调,通过抑制SIRT1及其下游FOXO来抑制自噬流起始阶段蛋白Atg7和Beclin1在LECs中表达,从而减弱自噬对错误折叠蛋白和损伤细胞器的清除,导致ARC的发生[32]。Let-7c-3p通过靶向沉默LECs中的自噬流起始阶段基因Atg3表达,进而抑制氧化应激诱导的自噬和凋亡[33]。此外,let-7c-5p通过抑制NER基因ERCC6的表达阻止自噬溶酶体降解阶段,通过减少ERCC6的表达之后导致自噬相关蛋白LC3B、Beclin1和p62增加,表明自噬降解阶段受阻,随后该团队深入研究发现ERCC6所编码的蛋白CSB能够与一种参与自噬溶酶体降解的标记物VCP相互作用参与自噬降解。因此,let-7c-5p通过调控ERCC6/VCP通路影响自噬体的降解过程,参与ARC的发生发展[34]。此外,Has_circ_0004058通过miR-186/Atg7轴促进自噬小体的形成来抑制SRA01/04细胞凋亡[35]。有研究表明,自噬相关的lncRNA参与白内障的形成,敲低lncRNA的晶状体模型抑制了LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化,从而减弱LECs中的自噬活性[36]。lncRNA能否在白内障体内模型中调控自噬基因或者自噬通路来控制白内障的发生,还有待进一步探索和研究。

然而,也有一些学者持相反观点,认为ARC的形成与自噬流的过度激活有关,通过减弱自噬通量后,可减轻氧化应激和DNA损伤诱导的LECs衰老[37]。同时,有研究发现自噬降解底物p62的缺失与衰老相关的疾病有关,并证实p62可以通过延缓衰老来促进小鼠的寿命[38]。最近的一项研究中发现ARC患者的LECs中自噬水平显著增高,而p62蛋白水平显著降低,最终导致细胞存活率下降[39]。因此在氧化应激下,晶状体中过度活跃的自噬可能会导致细胞活力丧失,进一步促进ARC发生[40]。

最新的研究发现,许多药物可以调控自噬流的进程。在ARC衰老小鼠模型的LECs中,有学者发现低剂量二甲双胍通过激活AMPK途径和加速自噬溶酶体的降解过程,抑制衰老小鼠晶状体混浊,从而延缓ARC进程[41]。Xu等[42]研究发现D-半乳糖显著增加自噬降解底物蛋白p62的表达,抑制成熟的自噬小体LC3的降解,通过损害自噬流和线粒体功能诱发LECs衰老,而二甲双胍可以通过降低ROS含量、增加ATP和MMP水平来改善线粒体功能,抑制D-半乳糖诱导的LECs衰老。目前的研究可以证明,自噬流调控是ARC发生的重要机制,因此,开发调控自噬流通路的药物可以为ARC的防治开辟新途径。

2.3糖尿病性白内障糖尿病性白内障(diabetic cataract,DC)是糖尿病的常见并发症,是糖尿病患者视力受损和失明的主要原因。DC的潜在机制尚不清楚,氧化损伤和EMT机制比较公认。研究显示,在DC患者的前囊膜LECs中Atgs的表达、AMPK及其下游调节因子TFEB和FOXO3的活性受到抑制,初步表明自噬活性下降与DC发病机制密切相关[43]。

在DC的发病机制研究中,高糖会导致LECs氧化损伤,而自噬能够显著减轻高糖诱导的LECs氧化损伤[44]。例如,补清颗粒通过促进LECs内Beclin1蛋白表达,减弱mTOR在小鼠晶状体中对自噬流的抑制作用,从而促进自噬流的发生达到对DC小鼠起到治疗作用;深入研究发现,补清颗粒还通过影响线粒体自噬相关受体蛋白BNIP3/NIX、PINK1/PARKIN的表达,上调线粒体自噬活性以清除受损线粒体,减轻高糖诱导的LECs线粒体损伤,延缓DC的发展[45-47]。此外,Liu等[48]研究发现在DC的小鼠模型LECs中,伴随着持续的高糖刺激下,LC3水平虽然显著升高,但是自噬降解底物蛋白p62先降低后升高,表明自噬流虽然在早期高糖刺激下增强,但在持续高糖刺激后发现自噬流被阻断。随后的实验发现,超氧化物歧化酶2和过氧化氢酶先增加后降低,提示高糖诱导LECs中ROS生成增多,而随着高糖刺激时间的延长,LECs内抗氧化防御机制下调,从而导致LECs发生氧化损伤导致自噬流降解阶段异常,进而诱发DC。

据报道,LECs的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)也是DC的发病机制之一[49],在DC的发展过程中,自噬参与LECs的EMT过程,研究证实高糖促进EMT,而雷帕霉素不仅能够激活自噬并且显著抑制EMT通路,同时使参与EMT的关键转录因子Snail和p62水平下降,因此激活自噬可能改善DC中的晶状体纤维化[50]。然而,过度活跃的自噬会加剧DC进展。程荣等[51]在1型糖尿病模型鼠LECs中检测到自噬功能失调,自噬水平明显增高,表现为自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、p62水平升高。尽管糖尿病模型鼠LECs中自噬体明显增加,但是自噬小体和溶酶体结合能力出现明显异常,成为诱发DC的关键。Li[52]研究表明高糖会激活HLECs中的自噬,过度活跃的自噬促进HLECs迁移并增加TGF-β的表达,参与DC的发生发展。据报道,miR-30a在DC患者的LECs组织中表达下降,同时,miR-30a可以通过靶向自噬起始阶段基因Beclin1降低高糖诱导的自噬水平[53]。

先前的研究表明抗氧化剂如甘氨酸、姜黄素、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽乙酯(GSH-EE),能够延缓DC的发生发展[54-56]。最新的研究表明,姜黄素类似物C1可以激活TFEB,增强溶酶体的生物合成和保护性自噬,从而减轻高糖诱导的DC[57]。此外,也有研究发现白藜芦醇作为一种有效的抗氧化剂,通过激活p38激酶家族信号通路(MAPK)激活自噬,从而抑制高糖诱导的HLECs氧化损伤[44]。尽管已经证明有药物可以控制DC的进展,但这些药物尚未应用于人类眼科疾病的临床,未来还需要更深入的研究。

2.4后发性白内障后发性白内障(posterior capsular opacification,PCO)是白内障手术后最常见的术后并发症,主要由术后晶状体囊内残留LECs的增殖、迁移和EMT等形成[58]。防止PCO的有效方式是在白内障摘除术中尽量消除晶状体囊袋内的LECs或抑制残留的LECs增生和迁移。

近来,一些学者开发载药人工晶状体,通过加入药物激活自噬,从而抑制LECs的增生和迁移[59]。据报道,环孢素A是一种免疫抑制剂,在体外可以抑制LECs增殖[60]。深入研究发现,经环孢素A处理后的LECs中LC3Ⅱ表达显著增加,而细胞存活率严重下降,随后通过体外实验发现环孢素A诱导细胞自噬性死亡,防止PCO的形成,揭示自噬在PCO防治方面的重要作用[61]。同样,在载药人工晶状体中注入聚氨基酰胺(PAMAM)聚合物后,发现自噬增强,LC3Ⅱ水平增加,有效地抑制白内障术后PCO发生,并且不会对其他眼部组织造成损害[62]。

此外,有研究首次在ARC患者术后分析LECs凋亡的情况,发现1%台盼蓝诱导LECs自噬性细胞死亡,表明1%台盼蓝染色有助于降低白内障术后PCO发生率[63]。Liu等[64]研究发现莱菔硫烷(sulforapgane,SFN)可诱导ROS,并激活MAPK信号通路,通过增加LC3Ⅱ和自噬囊泡的形成,促进HLECs自噬性死亡,从而延缓PCO进程。最近一项预防PCO的研究表明PP242在体外显著抑制mTORC1和mTORC2介导的信号通路,抑制LECs的增殖和迁移,并诱导细胞凋亡,需要进一步研究确定自噬和mTOR信号通路在LECs死亡中的调节机制[65]。关于细胞死亡和自噬与PCO之间的联系的研究将在未来引起人们的广泛关注。

EMT是术后PCO形成的重要机制。而有研究发现白内障手术刺激导致房水中的TGF-β2显著升高,是触发EMT的关键因素[66],EMT导致后囊膜混浊,被称为纤维性白内障[67],抑制EMT可能是治疗PCO的有效途径之一。Sun等[68]研究证实TGF-β2促进LECs中初级自噬小体LC3Ⅰ向成熟自噬小体LC3Ⅱ的转化和p62的降解,从而促进自噬小泡的形成和自噬溶酶体的融合降解过程,说明过度活跃的自噬将导致LECs发生EMT,进而诱发PCO。Atg7基因沉默通过降低LC3脂质化,抑制TGF-β2在LECs中诱导的纤维化作用,延缓PCO的发展。此外,自噬抑制剂可通过抑制Smad2/3的磷酸化,减弱TGF-β2途径,这表明调控TGF-β/Smad信号通路抑制自噬,可能延缓LECs中EMT。Li等[69]研究表明柚皮素(NRG)可通过减弱Smad2/3磷酸化,抑制HLECs自噬和EMT,为预防和治疗PCO提供了自噬相关的见解。目前,对于自噬流调控与PCO关系的研究,主要是检测自噬标志物水平,具体的调控机制还有待进一步研究。

3 总结和展望

综上所述,自噬在白内障中起着双重作用,良性自噬可以减少氧化应激以维持细胞内稳态,而在其他条件下,毒性自噬的上调导致自噬性细胞死亡。虽然自噬在白内障中的作用得到了一定的研究,但其在白内障中的具体作用机制、分子通路、相互作用等还有很多未知,有待进一步研究。同时,针对自噬流调控机制的药物和非编码RNA等干预靶标值得早日在动物体内模型中开展转化实验。因此,深入研究并了解自噬在白内障眼病中的调控机制,可以为白内障患者的防治提供针对性的选择。