不同枸杞品种嫩茎游离氨基酸的区域化差异

熊武来,李佳佳,国靖,郭起荣,汪贵斌

(南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,江苏 南京,210037)

枸杞为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium),多年生落叶灌木,原产于我国。果、叶、茎、花均可利用,药用和营养保健价值高,是传统的药食同源植物,在我国和东南亚等地区大规模种植[1]。目前关于枸杞的研究主要集中在枸杞果实和叶的功能成分提取与分析、产品开发利用等方面[2-3]。枸杞嫩茎可作为绿色无公害蔬菜,以及茶叶和功能性食品等的原料,其具有枸杞叶和果的部分功效,有很好的消费市场[4],但目前对枸杞嫩茎营养价值的研究较少[5]。

氨基酸是蛋白质的构建模块,而蛋白质是人体中肌肉、器官、酶等的组成部分[6]。氨基酸可以帮助修复、恢复和建立人体组织,人体不能像储存脂肪一样存储氨基酸,且人体本身不能合成必需氨基酸(essential amino acid,EAA),因此,需要从食物获得氨基酸,这使得氨基酸的地位至关重要。游离氨基酸(free amino acid,FAA)是枸杞嫩茎的主要营养成分,可被人体直接吸收利用,参与体内的生理活动。FAA也是一种呈味物质,普遍存在于植物中,其组成及含量的差异会导致食用时出现酸、甜、苦等多样的味感,可能是茶的风味和保健功能的主要贡献者[7-8]。FAA及其组成成分含量是评价食品质量及营养价值的重要指标,充分了解食品原料的氨基酸组成,对于产品开发具有指导意义[9-10],联合国粮农组织建议将可消化或生物可利用氨基酸的数据列入食物表[11]。目前,关于枸杞嫩茎中氨基酸组成的信息研究很少[5]。本研究以3个种植地的4个枸杞品种为研究对象,测定分析枸杞嫩茎中FAA组分及其含量的差异,并对其进行综合评价,以期为进一步认识枸杞嫩茎的营养和药用价值及其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2020年,以4个优良枸杞品种的1年生扦插苗为造林材料,分别种植于江苏盐城、青海德令哈和甘肃玉门。4个品种分别是宁夏神杞农林科技有限责任公司培育的‘宁杞1号’,青海海西州农业科学研究所培育的‘柴杞1号’、‘柴杞2号’和‘柴杞3号’。采取随机区组试验设计,3个重复,每重复40株扦插苗。扦插苗长势基本一致,主干粗为(3.0±0.5) mm,株高为(40±10) cm,株行距为1 m×2 m。2021年9月,每个区组选择30株树,每株从东、南、西、北、中5个方向采摘健壮、无病虫害的嫩茎,将嫩茎于50 ℃烘箱中烘干,磨碎后过200目筛备用[3]。

气象数据来源于中国气象数据网(http://data.cma.cn/),试验地气候条件见表1。

1.2 仪器与试剂

S-443D全自动氨基酸分析仪,德国Sykam公司;FD5型冷冻干燥仪,美国SIM公司;Milli-Q超纯水一体机,美国Millipore公司;氨基酸标准溶液、稀释缓冲液(12 g/L柠檬酸,pH 2.20的柠檬酸钠缓冲液)。

1.3 试验方法

1.3.1 FAA测定

参考GB/T 30987—2014《植物中游离氨基酸的测定》,略有改动。精确称取样品粉末0.2 g,加入烧杯中用10 mL的沸水冲泡,95 ℃水浴加热振荡,每隔5 min摇匀一次,提取10 min后取出,利用布氏漏斗和滤纸趁热抽滤,将滤液进行真空冷冻干燥[12]。再加入稀释缓冲液溶解,过0.45 μm滤膜得待测液,置于全自动氨基酸分析仪自动进样器上进样分析,对17种FAA进行上机检测。分析条件如下:色谱柱LCAK06/Na;流动相A(0.012%柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH 3.45),B(0.02%柠檬酸-柠檬酸钠,pH 10.85);58～74 ℃梯度控温;流速洗脱泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min;压力3～4 MPa;紫外检测波长570和440 nm[12]。

1.3.2 氨基酸营养评价

氨基酸评分(amino acid score,AAS)是将所有EAA分别与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织提出的人体EAA模式进行比对,用于简单地评价食物蛋白质营养价值[12]。必需氨基酸指数(essential amino acid index,EAAI)是将蛋白质中所有EAA的含量作为一个整体,对蛋白质质量进行营养评价的指标,能够反映EAA组成结构的总体营养价值。通常EAAI≥0.90时认定为优质高效的蛋白质,0.70≤EAAI<0.90为中等营养价值,当EAAI<0.70时为低品质。AAS和EAAI计算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:a,EAA含量;p,待测氨基酸;s,参考评分模式氨基酸,依次为Phe+Tyr:3.8,Met+Cys:2.7,Lys:4.5,Thr:2.3,Val:3.9,Ile:3.0,Leu:5.9,His:1.5;n,参与计算EAA数量[12]。

1.3.3 味道强度值(taste active value,TAV)的计算

按照氨基酸呈味差异,可以大致把氨基酸分为鲜味氨基酸(Glu、Asp、Lys)、甜味氨基酸(Thr、Gly、His、Ala、Pro、Ser)、苦味氨基酸(Met、Arg、Val、Leu、Ile)和芳香族氨基酸(Phe、Tyr),TAV指呈现味道的物质含量值与呈现味道物质味觉阈值的比值[12-14]。TAV与其呈味物质呈正相关,当TAV>1时,表示该物质对整体风味有贡献,TAV<1时则贡献较小[12]。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2010进行数据统计分析,计算氨基酸平均值、标准差及变异系数,SPSS 22进行方差分析,Duncan多重比较,P<0.05差异显著,有统计学意义,Origin 2021作图。枸杞嫩茎各氨基酸含量存在差异,根据各氨基酸含量相关性大小,通过SPSS 22将17种氨基酸降维成3个综合指标,以3个主成分指标进行综合指标评价。

2 结果与分析

2.1 种植地和品种对枸杞嫩茎FAA组分和总量的影响

不同品种及种植地枸杞嫩茎的FAA组分和总量均存在显著差异(P<0.05)(表2、表3)。3个种植地的4个枸杞品种嫩茎均含有17种FAA,平均含量从高到低依次为脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、异亮氨酸(Ile)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)。整体上,种植地和品种中,Pro含量最高,其次为Ser和Thr,Gly含量最低。

青海德令哈‘柴杞1号’的游离氨基酸总量(total free amino acids,TFAAs)含量最高,江苏盐城‘宁杞1号’最低(图1)。种植地和品种中,青海德令哈和‘柴杞1号’的TFAAs含量分别显著较高。其中青海德令哈枸杞嫩茎的Pro含量,显著高出江苏盐城和甘肃玉门(表2)。各种植地中,枸杞嫩茎TFAAs含量变异程度最大的是江苏盐城,青海德令哈变异程度最小(表3)。枸杞品种中嫩茎TFAAs变异程度最大的是‘宁杞1号’,‘柴杞3号’变异程度最小。以上结果说明,不同种植地和品种枸杞嫩茎的氨基酸总量变幅大,种植地和品种差异能够影响Pro等FAA的含量,从而影响TFAA。

2.2 种植地和品种对枸杞嫩茎EAA含量的影响

品种及种植地对枸杞嫩茎EAA的含量产生了显著影响(图2)。江苏盐城‘柴杞3号’的EAAs

图2 不同种植地和不同品种枸杞嫩茎中EAA含量Fig.2 Content of EAAs in tender stems of L. barbarumin different planted places and varieties

含量最高,高出甘肃玉门‘宁杞1号’271%。江苏盐城‘柴杞1号’、‘柴杞2号’和‘柴杞3号’的EAAs含量显著高于青海德令哈和甘肃玉门。‘宁杞1号’在各品种中EAAs含量较低。江苏盐城的Cys、Val、Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys这8种EAA含量均显著高于其他种植地,且这8种氨基酸占江苏盐城TFAAs含量的31.62%,显著高于青海德令哈的9.46%和甘肃玉门的10.41%,其绝对含量也是其他两地的2倍(表2)。种植地间变异系数最大的是玉门,为26.88%,最小的是青海,为5.95%。变异系数最大的品种是柴杞3号,为39.84%,变异系数最小的是柴杞1号,为19.92%(表4)。

表4 不同品种、不同种植地间EAA的方差分析及变异程度Table 4 Variance analysis and variation degree of EAAs among different varieties and planted places

2.3 种植地和品种对枸杞嫩茎药用氨基酸含量的影响

如图3所示,种植地对枸杞嫩茎的药用氨基酸含量影响差异显著(P<0.05)。江苏盐城‘柴杞3号’的药用氨基酸含量最高,甘肃玉门‘宁杞1号’的药用氨基酸含量最少。江苏盐城枸杞嫩茎的药用氨基酸含量占TFAAs含量的38.60%,远高于青海德令哈的9.36%和甘肃玉门的9.56%。不同品种枸杞的嫩茎中,‘柴杞1号’药用氨基酸含量最高,‘宁杞1号’最低。除‘宁杞1号’品种外,江苏盐城中Met、Leu、Tyr、Phe、Lys、Arg、Asp这7种药用氨基酸的含量显著高于其他种植地(P<0.05)(表2)。变异系数最高的种植地是玉门,为27.97%,最低是青海(12.20%)。变异系数最大的品种是‘柴杞3号’,为60.04%,‘柴杞1号’最小,为43.59%(表5)。

图3 不同种植地和不同品种枸杞嫩茎中药用氨基酸含量Fig.3 Contents of medicinal amino acids in tender stems ofL. barbarum in different planted places and varieties

表5 不同种植地和品种间药用氨基酸含量的方差分析及变异程度Table 5 Variance analysis and variation degree of medicinal amino acid content between different planted places and varieties

2.4 枸杞嫩茎氨基酸营养评价

2.4.1 AAS和EAAI

江苏盐城枸杞嫩茎的AAS>1,符合营养模式标准(图4)。总体上江苏盐城的枸杞EAA组成优于青海和玉门。Thr和His是AAS指数中最高的氨基酸,而Ile的AAS<1,比其他氨基酸AAS值均小,说明其含量较低,属于第一限制性氨基酸[12]。江苏盐城枸杞品种的嫩茎EAAI得分最高,分别为141.47%、133.30%、138.97%、141.18%,原因在于其Thr和Leu的比例较高(图5)。青海和玉门的EAAI都低于70%,属于低营养值。

图4 三个种植地不同枸杞品种嫩茎AAS Fig.4 AAS of tender stems of different L. barbarum varieties in three planted places

图5 三个种植地不同枸杞品种EAAI Fig.5 EAAI of tender stems of different L.barbarumvarieties in three planted places

2.4.2 呈味特征和TAV分析

枸杞嫩茎的呈味氨基酸组成模式相似,贡献较大的是甜味氨基酸和鲜味氨基酸,苦味氨基酸含量较少,芳香族氨基酸最少(图6)。其中,青海种植的枸杞甜味氨基酸含量最高,其中最高的品种是‘柴杞1号’。

图6 呈味氨基酸含量Fig.6 Contents of flavor amino acids

经TAV转换后,大部分氨基酸TAV<1,对枸杞嫩茎风味无贡献(表6)。除玉门‘宁杞1’号外,甜味氨基酸His在不同地点和品种都对味觉有影响,贡献甜滋味。另外,江苏盐城的‘柴杞1号’‘柴杞2号’‘柴杞3号’的Asp、Ser、Val分别贡献了鲜味、甜味、苦味,青海 ‘柴杞1号’‘柴杞2号’‘柴杞3号’的Ser>1,青海和玉门枸杞嫩茎的Pro都贡献了甜滋味。

表6 不同品种和种植地枸杞呈味氨基酸TAV Table 6 Taste activity values of avor amino acids in different L. barbarum varieties of three planted places

分类氨基酸TAVYCC1YCC2YCC3YCN1QHC1QHC2QHC3QHN1YMC1YMC2YMC3YMN1均值味道阈值/(mg/g)鲜味Glu0.280.340.341.300.920.860.840.730.510.480.450.480.630.30Asp1.381.101.140.600.170.150.130.060.070.070.130.080.421.00Lys0.860.881.120.610.600.680.550.520.690.430.450.300.640.50甜味Thr0.240.230.260.160.400.300.360.350.240.290.220.130.262.60Gly0.040.040.050.020.040.040.030.040.040.020.020.020.041.30His2.012.222.741.731.691.661.471.351.611.141.190.771.630.20Ala0.580.480.680.310.550.510.421.040.460.390.370.230.500.60Pro0.460.550.550.234.123.653.443.843.093.073.221.732.333.00Ser1.171.551.690.801.401.241.100.670.720.740.620.451.011.50苦味Met0.330.310.440.230.240.220.200.130.270.130.170.090.230.30Arg0.600.540.740.320.420.370.350.240.330.200.210.120.370.50Val1.171.051.250.860.520.630.520.540.620.430.430.280.690.40Leu0.300.260.340.170.180.200.160.130.200.110.120.080.191.90Ile0.320.270.320.140.110.130.100.130.140.090.090.050.160.90芳香族Phe0.570.550.670.330.220.250.180.230.230.150.160.110.630.30Tyr0.220.830.250.110.080.090.070.100.130.070.070.040.421.00

2.4.3 枸杞嫩茎FAA主成分分析

对3个种植地4个品种枸杞嫩茎的17种氨基酸进行主成分分析,前3个主成分对应特征值均大于1,累计方差贡献率为85.09%,基本上包括了17种氨基酸的大部分信息,因此选择前3个主成分作为综合指标对其品质进行综合评价[3]。如表7所示,PC1贡献率63.20%,变量Phe、Val、Ile、Leu、Arg、Lys、His、Cys、Met、Asp、Ser有较高载荷。PC2贡献率为15.58%,Thr、Pro、Ala、Gly具有较高载荷量。PC3贡献率为6.31%,Ala、Glu有较高的载荷,其中Ala符号为负,说明Ala与之呈显著负相关(表7)。

根据表7计算出特征向量,再以特征向量构建3个主成分的表达函数式[3]:

F1=0.283X1+0.001X2+0.244X3-0.106X4+0.028X5+0.09X6+0.29X7+0.299X8+0.288X9+0.299X10+0.297X11+0.14X12+0.302X13+0.29X14+0.294X15+0.294X16-0.199X17

F2=-0.162X1+0.574X2+0.233X3+0.200X4+0.328X5+0.383X6-0.157X7-0.034X8+0.083X9-0.031X10+0.084X11-0.189X12-0.041X13+0.132X14+0.098X15+0.129X16+0.417X17

F3=0.013X1-0.167X2+0.127X3+0.684X4+0.296X5-0.471X6-0.046X7+0.072X8+0.139X9-0.111X10+0.014X11-0.282X12-0.016X13+0.12X14+0.011X15+0.065X16-0.204X17

式中:X1、X2……X17分别表示Phe、Val…Glu等原始数据的标准化值。

3个主成分从不同方面体现了不同品种及地点枸杞嫩茎中氨基酸总体水平,单独使用1个主成分并不能对不同品种及地点枸杞嫩茎中氨基酸的质量作出综合性评价,因此根据主成分分析结果,以3个主成分对应的方差相对贡献率作为权重建立综合评价模型[14]:

F=0.743F1+0.183F2+0.074F3

根据主成分综合得分模型,计算出3个地点枸杞品种的综合得分值和排序结果(表8)。综合得分由大到小依次为柴杞3号(盐城)、柴杞1号(盐城)、柴杞2号(盐城)、柴杞1号(青海)、宁杞1号(盐城)、柴杞2号(青海)、柴杞1号(玉门)、柴杞3号(青海)、宁杞1号(青海)、柴杞3号(玉门)、柴杞2号(玉门)、宁杞1号(玉门)。

表8 三个地点不同品种枸杞嫩茎综合得分Table 8 The comprehensive score of tender stems of different L. barbarum varieties in three places

3 讨论与结论

3.1 种植地对枸杞嫩茎氨基酸含量的影响

不同种植地氨基酸含量和营养品质具有较大差异[3]。这与不同产地枸杞叶、果的氨基酸成分种类差异不大,但含量差异较大[15-16],枸杞产量和品质受到种植地温度、光照、降雨等生态环境影响[17]的报道相一致。种植地的气候因子充当植物生长、发育、代谢的信号分子,起着综合性调节作用,参与了多种生理过程,包括氨基酸的积累和消耗利用[18]。相关研究表明,氨基酸及其衍生物可调节植物细胞的渗透压,保持细胞水分,提高植物的抗旱性和耐寒性[19]。因此,低温干旱胁迫可以促进植物体内FAA积累[20]。本研究也得到了相似结果,即在高海拔、年均气温低和年降雨量少的青海德令哈和甘肃玉门两地的TFAA明显高于江苏盐城。刘建兵[21]发现干旱胁迫下,马尾松通过调节次生代谢产物脯氨酸及FAA含量响应环境中的水分缺乏,使苗木适应干旱环境而继续生长。胡立群等[22]研究发现,植物中氨基酸含量在低温和干旱胁迫下迅速积累。脯氨酸等氨基酸组分含量的差异已被证明是植物对种植地气候等非生物胁迫的适应性反应。植物中脯氨酸含量随着所需水分减小而升高,这与干旱胁迫下脯氨酸合成增加,降解减少有关[23]。脯氨酸是中性氨基酸,具有高溶解度,在细胞中大量积累时,既不引起细胞内酸碱度变化,又能降低细胞水势,可有效缓解干旱胁迫对植物的伤害[23]。因此,种植地的干旱环境可能会使枸杞中脯氨酸含量增加。本研究中,青海德令哈和甘肃玉门的枸杞嫩茎脯氨酸含量均比盐城的高出数倍。

除了氨基酸含量和组分与产地有关,植物中氨基酸营养价值和药用价值的差异可能与产地有关[24]。徐丹萍[25]的研究表明,气候特点对花椒品质优劣具有决定性作用,适宜的气候环境条件对花椒的生长、发育、品质具有重要影响。降水量丰富且集中、年蒸发量相对较低有助于植物土壤中储存更多的雨水,而雨水中溶有充足的氧气,冲洗掉土壤中更多的盐分,且雨水中的氮元素增加了土壤中水解氮含量,有利于植物根、叶吸收,同时促进部分药用氨基酸的合成[26]。本研究中盐城枸杞嫩茎药用氨基酸含量占总氨基酸的38%左右,高于部分中药中的药用氨基酸含量[13]。这与其高温、高降雨量、雨热同季等气候条件相关。

3.2 枸杞嫩茎品种间氨基酸含量的差异

同一地区不同枸杞品种氨基酸含量和营养品质差异较大,品种间理化性质和FAA谱存在较大差异[27]。王益民等[28]对10个枸杞品种果实进行氨基酸含量分析,认为不同品种间氨基酸的差异反映出不同种质间的积累特征。刘伟等[14]的研究表明,不同黄花菜品种之间氨基酸总量、人体EAA、呈味氨基酸及限制氨基酸的含量均存在较大差异。这些研究无疑表明植物氨基酸的合成与代谢规律与植物种质资源多样、遗传背景复杂,各个品种赋予特有的种质属性有关[27]。与前人在品种间氨基酸差异的研究结果相似[29-30],本研究发现4个枸杞品种种植于同一种植地,且栽培管理措施和立地环境基本一致时,品种间氨基酸组分和总量、EAA呈味氨基酸存在较大差异性,推测不同品种间氨基酸含量的差异可能主要是由于其自身的遗传特性所致[29]。

不同品种的氨基酸含量不同,会导致其营养价值和食药用功效的差异,在开发和利用时可根据不同的目的选择不同品种,以充分发挥其品种优势功效[30-31]。王馨雨等[32]研究表明兰州百合甜味氨基酸含量丰富,适合于百合休闲食品开发,丰富市场,而卷丹百合品种EAAs和药用氨基酸均较高,可对品种进一步改良,发扬药用品种优势。本研究中,‘柴杞1号’的呈味氨基酸含量和药用氨基酸含量均为所有品种中最高,说明其在食药用开发上可能具有遗传学上的优势。

3.3 枸杞嫩茎氨基酸含量的种植地和品种交互效应

赵琼玲等[33]研究表明影响余甘子果实氨基酸组成和总量的主要因素为品种和环境。本研究中也发现,枸杞嫩茎氨基酸组分、总量、EAA含量、药用氨基酸含量在3个种植地4个品种差异显著。根据主成分分析从17种FAA中提取到3个主成分综合评价,其累计方差贡献率为85.09%,较好地反映枸杞嫩茎FAA品质的综合信息。综合排名上,江苏盐城总体上得分较高,这可能是与盐城适宜的气候有关。‘柴杞1号’在3个地点的排名整体上都高于另外3个品种,说明‘柴杞1号’枸杞9月份嫩茎比‘柴杞2号’‘柴杞3号’‘宁杞1号’嫩茎综合营养品质高。由于本实验选择的枸杞样品和种植地仅有4个品种和3个种植地,并未包括我国所有枸杞品种和不同气候条件的种植地,因此还需扩大种植品种和地方范围,详细调查气候条件和管理方式,设计实验,明确品种和气候因素对枸杞嫩茎氨基酸营养品种的影响,为枸杞嫩茎的营养与特征风味研究等开发利用提供更多理论依据。