合肥市原发性肉碱缺乏症新生儿筛查及基因变异分析

胡海利 李卫东 王 燕 宋旺生 马庆庆

1.合肥市妇女儿童保健中心（安徽合肥 230092）；2.安徽省妇幼保健院（安徽合肥 230001）

原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD）是脂肪酸代谢障碍类疾病之一，是由于肉碱转运蛋白SLC 22A5基因变异引起的一种脂肪酸β氧化代谢病，由于转运蛋白活性降低，导致由肠道摄入的肉碱不足，体内游离肉碱（free carnitine，C0）降低，脂肪酸氧化代谢障碍，引起能量代谢障碍和低血糖，又称为肉碱摄取障碍或肉碱转运障碍[1]。在目前可查及的文献中，该病的检出率国内外差异较大，法罗群岛的检出率最高，达1/400[2]，澳大利亚检出率最低（1/120000）[3]。国内的检出率为1/34517～1/11189[4-5]。

随着串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查（以下简称“新筛”）中的广泛应用，越来越多的PCD新生儿患者获得早期筛查和确诊。该病早期诊断的重要意义在于早防早治、避免功能损害和猝死，特别是学龄期患儿在学校体育课要尽量避免长跑或其他高强度运动，从而避免意外发生。确诊患儿还可以通过早期服用左卡尼汀避免该病对身体器官功能的长期损害。

现对合肥市新生儿疾病筛查中心近6 年串联质谱检测结果进行分析，探讨本地区PCD 检出情况，分析本地区PCD检出率与其他地区的差异、确诊患儿基因变异类型及常见位点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2016 年1 月至2021 年12 月在合肥市各级助产机构分娩的新生儿共631 839例。本研究已获得医院医学伦理委员会批准（批号：2016-003），患儿家长均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 新生儿筛查方法 按照《新生儿疾病筛查技术规范2010 年版》的要求，由分娩机构产科护理人员采集新生儿足底血，制成干血滤纸片，由新筛物流系统统一递送至合肥市新筛中心。采用美国Waters公司生产的Waters TQD 串联质谱仪进行高效液相串联质谱检测，实验试剂采用由芬兰PE 公司生产的非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒。C0 参考值范围10～55 μmol/L，如初筛血值＜10μmol/L者，召回新生儿及其母亲进行串联质谱检查，结果仍然偏低者进行基因检测。

1.2.2 基因变异检测方法 抽取患儿及父母静脉全血3 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝处理后，快递至北京迈基诺医学检验所，采用北京天根DP 318-03分离试剂盒提取DNA，–20℃保存备用。靶向外显子捕获后，进行二代测序（NGS），测序范围包括10 个外显子和外显子上下游200 个碱基对的内含子，对患儿及其父母SLC 22A5基因可疑变异位点进行一代测序验证，可疑大片段缺失重复进行多重连接探针扩增技术验证。所有变异位点的筛选分析依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）2015指南。

1.2.3 干预与随访 对确诊的PCD患儿，按照《原发性肉碱缺乏症筛查与诊治共识》[6]及时给予左卡尼汀100～300 mg/(kg·d)，婴儿期C0 浓度监测1～3个月1次，儿童期每年2～3次，根据血浆C0浓度适当调整药量。每年监测1次肝肾功能、血糖、血红蛋白、肌酸激酶等，每半年进行1次体格发育评价。做好家长宣教工作，避免患儿停药、饥饿、剧烈运动等应激状态。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的以中位数（M）（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 近6年合肥市串联质谱筛查及PCD发病情况

从2016 年至2021 年，全市活产数661 172 例，串联质谱新生儿筛查数631 839 例，总体筛查率95.6%，年度筛查率从2016至2021年逐年升高。确诊PCD 患儿32 例，其中临床+基因诊断30 例，临床诊断2 例（1 例行基因检测但未检出变异位点，1例因家长拒绝未行基因检测），PCD总体发病率为1/19745。见表1。

表1 2016—2021年合肥市新生儿串联质谱筛查及PCD检出情况

2.2 PCD患儿临床特点及串联质谱检测C0结果

32 例患儿中，男20 例、女12 例；足月儿29 例，早产儿3 例；31 例出生体重正常，1 例为巨大儿。出生时未见其他缺陷及异常，确诊时未出现临床症状，患儿肝肾功能和血糖未见异常。有4 例患儿分别在1岁1个月、1岁5个月、1岁10个月、2岁1个月出现肌酸激酶增高。C0 初筛血值最低值为2.20 μmol/L，最高值为8.75 μmol/L，均数为（5.90±1.75）μmol/L，其中男孩（5.83±1.66）μmol/L，女孩（6.03±1.96）μmol/L，男、女孩差异无统计学意义（t=0.30，P=0.512）。C0确诊血值最低值为2.14μmol/L，最高值为9.30 μmol/L，均数为（5.02±1.73）μmol/L，其中男孩（5.13±1.83）μmol/L，女孩（4.83±1.60）μmol/L，差异无统计学意义（t=0.47，P=0.492）。

2.3 PCD基因检测结果

32例临床诊断为PCD的患儿中，31例进行高通量测序联合Sanger 验证，30 例检出基因变异，其中复合杂合变异25例、纯合变异5例，1例未检出基因变异，基因确诊率为96.8%（30/31）。在基因检测阳性的30 例患儿SLC 22A5基因的60 个变异中，变异比例最高的为c.1400C＞G，占48.3%（29/60），其次为c.51C＞G，占15.0%（9/60）。有24例患儿至少携带1个c.1400C＞G，携带率为80.0%（24/30）。有8例患儿检出c.51C＞G/c.1400C＞G基因型（26.7%，8/30），5 例检出c.1400 C＞G/c.1400 C＞G 基因型（16.7%，5/30）。见表2。

基因确诊的30 例患儿中男18 例、女12 例。复筛血值低于初筛血值24 例，复筛血值高于初筛血值6 例。在6 例复筛血值增高的患儿中有5 例携带c.1400C＞G变异。见表2。

2.4 C0血值与c.1400C＞G变异关系

根据是否携带c.1400C＞G变异，将患儿分为携带组和不携带组，其中携带组24 例。携带组的初筛C0值、确诊C0值均高于不携带组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间血C0值下降（初筛C0值-确诊C0值）差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 是否携带c.1400C＞G变异在初筛和确诊时C0值比较(μmol·L-1)

3 讨论

合肥市新生儿串联质谱筛查起步于2015年7月，2016年开始在全市范围内针对常住人口实行部分免费新生儿串联质谱筛查，2018 年实行全免费，近几年串联质谱筛查率不断提高。针对PCD的筛查指标合肥市主要应用C0，从确诊的32例PCD患儿来看，所有患儿的C0均低于切值（10 μmol/L），提示串联质谱技术对于PCD的筛查灵敏度较高，但目前的筛查评估方法可能导致首次筛查血值略高于切值的患儿漏筛，尤其是初筛血值在10～15 μmol/L 同时伴有其他种类酰基肉碱的降低，在今后的工作中应予关注。从统计结果来看，不同年度PCD 的筛查检出率差异较大，这可能与PCD 是罕见病，某一年度由于筛查量的制约不能很好地反映PCD的真实疾病检出情况有关。从6 年60 多万例筛查总量看，合肥市PCD总体检出率为1/19745，高于河南省2013年至2017 年72 万多例新生儿的检出结果（1/34317）[5]，低于泉州54万多例新生儿的检出结果（1/11189）[4]、广州市2015年至2019年20万多例新生儿筛查检出结果（1/13345）[7]以及石家庄地区16万多例新生儿的调查结果（1/17785）[8]，与南京2013年至2018年新生儿筛查检出率（1/19607）相近[9]。从目前可查及的文献来看，由于PCD 为罕见病，且国内各地区的检出率均在1/20000 上下波动，显示PCD 的检出率在中国地区间的差异不明显。

本研究PCD患儿的基因诊断率为96.8%，高于相关研究对95例成纤维细胞肉碱转运体低下患者的调查结果（70.5%）[10]以及 40例初筛阳性PCD患儿的基因诊断率（35.0%）[11]。本研究的基因诊断率明显高于其他相关调查结果，可能与基因检测方法不同有关，也可能与合肥市PCD患儿的基因变异种类及分布有关。本研究有1 例临床确诊患儿做了基因检测，但未查及变异，可能是由于目前高通量测序方法主要对外显子区域及其侧翼序列上下游50 bp 深度的内含子进行测序，理论上可能会遗漏深度内含子区域及启动子区域变异，也可能是SLC 22A5基因甲基化修饰的原因。这需要在今后的工作中进一步加强基因诊断方法的研究，以提高检测技术水平以及基因诊断率。

本研究发现SLC 22A5c.1400 C＞G 基因变异是本地PCD 患儿的热点变异，占48.3%。其次为c.51 C＞G 基因变异（15.0%）。相关研究表明，c.51 C＞G 和c.1400 C＞G 变异分别占泉州地区SLC 22A5基因变异的第2 位和第3 位[4]，与本研究相近。有研究对2 093例正常新生儿进行SLC 22A5基因测序发现，柳州地区的热点变异为c.51 C＞G（56.5%）[12]。另有研究对12 例PCD 患儿进行基因分析发现，c.760 C＞T 和c.1400 C＞G 变异占比最高，分别为37.5%和29.2%[13]。本研究发现，携带SLC 22A5c.1400 C＞G 基因变异的患儿，初筛和确诊C0血值均显著高于不携带此变异的患儿，而且该基因变异相对于SLC 22A5其他类型的基因变异对血值下降的影响较小。这与相关研究发现SLC 22A5c.1400 C＞G 变异会减少肉碱转运，使血值下降，但其能保留较高活性的残余肉碱转运活性的结论相符[14]。

综上，串联质谱筛查技术能够有效筛查出C0偏低的新生儿，通过对SLC 22A5基因的二代测序技术对其进行检测，从分子层面对其进行确诊，从而验证临床诊断。这为PCD 患儿的早期治疗干预、再生育遗传咨询、产前诊断等都提供了重要的参考信息。