熔融尿素法提取废弃羊毛角蛋白的机制

萨如拉,曹 蝶,张志洁,杨晓雪,邢佳佳,刘 爽,宋媛媛

(赤峰学院 化学与生命科学学院,内蒙古 赤峰 024000)

羊毛作为一种天然蛋白质资源,其角蛋白含量高达95%,被认为是一种有巨大潜在价值的蛋白质资源[1-2]。山羊毛经提绒后残留大量的废弃粗长毛,回收利用率低,我国每年平均生产9 万t左右的粗长毛及废弃羊毛织物,它们的质量低下、加工难度大、不易降解,绝大部分都被废弃、填埋、焚烧而很难得到充分利用,不仅污染环境,而且浪费了大量的动物性蛋白资源[3-5]。开发新型羊毛角蛋白提取技术是实现废弃羊毛高效利用、经济、环保的途径[6-7]。羊毛主要成分为角蛋白[8],角蛋白由胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等18种氨基酸组成[9],具有亲肤性、生物相容性、对人体无毒无刺激性等多种优良特性,有较高的再生价值[10]。角蛋白的提取是废弃羊毛有效利用的至关重要的步骤,目前羊毛角蛋白的提取方法主要有氧化法、酸碱法、还原法、金属盐法、酶法、离子液体法、低共熔体系法、熔融尿素法[11-13]等。熔融尿素法采用价格低廉的尿素为原料,在尿素熔点(132.7 ℃)以上温度进行溶解羊毛试验。溶融尿素法用料单一,需要时间短,尿素和羊毛角蛋白的分离过程简便,羊毛溶解率较高,熔融后产生的尿素废液可以作为农业肥料回收利用[7-8]。利用熔融尿素法提取羊毛角蛋白绿色环保,具有实用价值,适合未来发展趋势。

根据Tanahashi等[14]、Murate 等[15]的研究,尿素溶解羊毛可能是熔融尿素在高温下分解产生氨气,进入角蛋白结晶区,破坏角蛋白之间的氢键所致。本文以羊毛为原料,采用熔融尿素法提取羊毛角蛋白,研究羊毛/尿素质量比、提取温度、提取时间对羊毛溶解率和羊毛角蛋白提取率的影响。同时,为了研究羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解机制,以白蛋白模拟羊毛角蛋白的化学键及结构,推测了羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解机制,为后续废弃羊毛的高效利用以及动物性纤维的再利用提供理论依据和技术支撑。

1 试验部分

1.1 试验材料及仪器设备

材料:羊毛(产于内蒙古克什克腾旗),色氨酸、苯丙氨酸、尿素、乙酸乙酯、硫酸钠、丙酮均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司),白蛋白(分子量40 000,北京亚米生物科技有限公司),纤维素透析袋(分子量8 000～10 000,上海源叶生物科技有限公司)。

仪器:HH-SA型高温油浴锅(金坛市顺华仪器有限公司)、CS101-AB烘干箱(重庆试验设备厂)、FA-1004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、BR4I型离心机(Thermo公司)、RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、GCMS-TQ8040型气相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 羊毛预处理

羊毛先用洗洁精清洗干净,再用蒸馏水清洗至无洗洁精残留,晒干,备用。

1.2.2 熔融尿素法提取羊毛角蛋白

称取一定量的尿素倒入烧杯中,把烧杯放入加热至一定温度的油浴锅中恒温加热,尿素完全熔融后放入一定量的羊毛溶解一定时间,从油浴锅中取出烧杯,为了防止尿素凝固,在烧杯中加入100 mL蒸馏水,过滤,烘干被截留物,作为不溶物。滤液装入纤维素透析袋中静止透析48 h(每12 h换一次蒸馏水),最后烘干透析袋中的溶液,得到主要成分为角蛋白的羊毛角蛋白[7-8]。羊毛的溶解率按式(1)计算,羊毛角蛋白的提取率按式(2)计算。

(1)

(2)

式中:D1为不溶物质量,g;D0为羊毛质量,g;D2为羊毛角蛋白质量,g。

1.2.3 白蛋白分子量的测定

准确称量4份6.25 g尿素倒入烧杯中,把烧杯放入160 ℃恒温油浴锅中使尿素完全熔融,在熔融尿素中各加入0.5 g白蛋白,分别反应10、20、40、80 min后取出烧杯,烧杯中加入100 mL 蒸馏水后倒入纤维素透析袋中进行静止透析 48 h(每12 h换一次蒸馏水),过滤透析袋中的溶液,沉淀为非水溶性蛋白,滤液为水溶性蛋白。以白蛋白为参照物,将水溶性蛋白为原料,以15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子量[16-17]。

1.2.4 白蛋白与熔融尿素的反应

准确称量6.25 g尿素倒入烧杯中,把烧杯放入 160 ℃恒温油浴锅中使尿素完全熔融,在熔融尿素中加入0.5 g 白蛋白,反应20 min 后取出烧杯,烧杯中加100 mL蒸馏水后倒入纤维素透析袋中进行静止透析,透析3 h后取透析外液150 mL,使用150 mL乙酸乙酯分液3次,取有机层,硫酸钠脱水有机层,浓缩干燥。称取浓缩物1 mg于10 mL离心管中,加入1 mL丙酮溶解,使用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行分析。

使用设备及测定条件: GC-MS-QP5050A;毛细管柱: DB-5MS(J&W Scientific)、0.25 mm (I.D.)× 30 m ( L) × 0.5 μm;载气He;电离方式EI;电离电压 70 eV。成分分析条件为:进样温度230 ℃;气化室温度300 ℃;升温程序:初始温度100 ℃保持5 min,以10 ℃/min 速率升至300 ℃,保持5 min;分析时间 5～30 min。

1.2.5 氨基酸与熔融尿素的反应

准确称量2份6.25 g 尿素倒入烧杯中,把烧杯放入160 ℃恒温油浴锅中使尿素完全熔融,熔融尿素中分别加入色氨酸和苯丙氨酸各0.5 g,反应20 min后取出烧杯,烧杯中加50 mL 蒸馏水,再加100 mL乙酸乙酯分液3次,取有机层,硫酸钠脱水有机层,浓缩干燥。称取浓缩物1 mg于10 mL离心管中,加入1 mL丙酮溶解,进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。使用设备及测定条件为同1.2.4节。

2 结果与分析

2.1 羊毛与尿素质量比对溶解率和提取率的影响

按照1.2.2节试验方法,称取5份1 g羊毛,分别放入7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g、160 ℃的熔融尿素中,反应20 min提取羊毛角蛋白,测试并计算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

羊毛/尿素质量比对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响如图1所示。随着尿素质量比例的增加,羊毛溶解率和角蛋白提取率也增加,当m(羊毛)∶m(尿素)达到1∶12.5时,溶解率和提取率都达到了最高值。m(羊毛)∶m(尿素)小于1∶12.5时,熔融尿素量较小,不能完全浸没羊毛,虽然有搅拌,但有些羊毛仍然未能与熔融尿素充分接触,导致溶解率和提取率较低。m(羊毛)∶m(尿素)增加至1∶12.5以上时,熔融尿素与羊毛能够充分接触,提高了羊毛溶解率和角蛋白提取率。m(羊毛)∶m(尿素)再增加时溶解率和提取率的提高幅度较小,基本不再提升,说明羊毛溶解率和角蛋白提取率都达到了最高值。因此,最佳羊毛与尿素质量比为1∶12.5。本文试验中提取率比溶解率低的可能原因为在160 ℃、20 min条件下,被溶解的羊毛蛋白质(高分子)的一部分被降解成较小分子的蛋白质或多肽,甚至有可能降解成氨基酸,部分分子量小于8 000的蛋白质、多肽、氨基酸透过透析袋进入了透析外液中被弃掉,因此提取率低于溶解率。

图1 羊毛与尿素质量比对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响Fig.1 Influence of wool/urea mass ratio on wool dissolution rate and keratin extraction rate

2.2 反应温度对溶解率和提取率的影响

按照1.2.2节试验方法,称取5份1 g羊毛,分别放入140、150、160、170、180 ℃的12.5 g熔融尿素中,反应20 min提取羊毛角蛋白,测试并计算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反应温度对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响如图2所示。虽然160 ℃时羊毛溶解率最高,但各加热温度条件下羊毛溶解率变化幅度较小。反应温度140 ℃、反应时间20 min以上时,能够溶于熔融尿素的羊毛角蛋白全部溶解。随着反应温度的上升角蛋白提取率逐渐下降,可能原因为反应温度较低时羊毛角蛋白的化学键不易断裂、角蛋白降解程度较低、角蛋白分子量较大,不易透过透析袋,较多的角蛋白留在透析袋中,因此角蛋白的提取率较高。但是随着反应温度的上升,角蛋白的有些化学键被断裂,高分子量角蛋白可能降解成低分子量的角蛋白、短肽、游离氨基酸等,容易透过透析袋,使提取率降低。

图2 反应温度对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

2.3 反应时间对溶解率和提取率的影响

按照1.2.2节试验方法,称取5份1 g羊毛,放入160 ℃、12.5 g熔融尿素中,分别反应10、15、20、25、30 min提取羊毛角蛋白,测试并计算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反应时间对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响如图3所示。随着反应时间的延长溶解率的变化幅度较小,反应时间20 min时溶解率最高,延长反应时间溶解率几乎不变,说明羊毛中能够溶于熔融尿素的成分已经全部溶解,因此最佳反应时间为20 min。随着反应时间的延长角蛋白提取率逐下降,在10 ～15 min之间的提取率下降的幅度较小为1.58%,但15～20 min之间的提取率下降的幅度较大为18.26%。在160 ℃高温熔融尿素中,羊毛角蛋白的一些化学键在反应时间小于15 min时不会断裂,超过15 min时逐渐断裂,部分高分子角蛋白降解成小分子蛋白、多肽、氨基酸等,这些小分子很容易透过透析袋,使羊毛角蛋白的提取率下降,并且反应时间越长角蛋白的降解程度越大,提取率越低。

图3 反应时间对羊毛溶解率和角蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of reaction time on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

综上所述,使用熔融尿素法提取羊毛角蛋白时羊毛与尿素质量比1∶12.5、反应温度160 ℃、反应时间20 min时,羊毛角蛋白全部溶解于熔融尿素中,但随着反应温度、反应时间的增加羊毛角蛋白的提取率降低。

2.4 溶解白蛋白的分子量测定

由于羊毛角蛋白的分子量未知[16],确认分子量降低程度的试样不充分,因此,以已知分子量的白蛋白为原料,以便于推测羊毛与熔融尿素反应后角蛋白分子量变化的规律。白蛋白与熔融尿素反应后分子量的测定结果如图4所示。参照白蛋白在分子量40 000 Da的位置出现了电泳带,反应时间10、20 min时,白蛋白分子量出现了片断性电泳带,分子量21 000～40 000 Da之间的位置有较浓的电泳带,分子量14 000 Da以下的位置有2条较淡的电泳带,可见10、20 min时大部分蛋白质仍然保持较高的分子量,但部分蛋白质已经降解成分子量小于14 000 Da的蛋白质或氨基酸。反应时间40、80 min时的白蛋白分子量在14 000 Da以下的位置出现了较浓的电泳带,可见大部分蛋白质降解成分子量小于14 000 Da的蛋白质或氨基酸。以上结果表明,白蛋白与尿素的反应时间越长,更多的白蛋白降解成低分子量蛋白质或多肽,甚至有可能降解成氨基酸。因此可以推测,虽然羊毛角蛋白的分子量较大、结构较复杂,但适宜的反应条件下熔融尿素使羊毛角蛋白降解、分子量降低。

图4 白蛋白分子量的测定Fig.4 Determination of albumin molecular mass

2.5 白蛋白、氨基酸与熔融尿素的反应

白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸与熔融尿素反应物的GC测定结果与色谱峰对应的化合物如图5所示。色氨酸与白蛋白反应透析外液都在保留时间26 min出现了色谱峰,通过MS进一步分析确定了二者26 min色谱峰的化合物为同一种化合物,即色氨酸与尿素反应产物。白蛋白与熔融尿素透析外液在保留时间26 min时化合物的峰值最大,可以确定在白蛋白降解过程中产生最多的氨基酸为色氨酸。苯丙氨酸与白蛋白反应透析外液都在保留时间19 min出现了色谱峰,通过MS进一步分析确定了二者19 min色谱峰的化合物为同一种化合物,即苯丙氨酸与尿素反应产物。通过以上试验结果可以看出,熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸,以此类推熔融尿素也可以使羊毛角蛋白降解成氨基酸。依据GC-MS检测结果推测的氨基酸、蛋白质与熔融尿素的反应机制如图6所示。

图5 色氨酸、白蛋白、苯丙氨酸与熔融尿素反应物GC测定结果与色谱峰对应的化合物Fig.5 Compounds corresponding to chromatographic peaks in the gc determination results of albumin, tryptophan, phenylalanine and molten urea reactants. (a)Albumin reacts with molten urea;(b)Tryptophan reacts with molten urea in dialysis fluid;(c)Phenylalanine reacts with molten urea

图6 氨基酸、蛋白质与熔融尿素反应机制Fig.6 Reaction mechanism of amino acid, protein and molten urea

色氨酸、苯丙氨酸和熔融尿素的第1阶段反应从氨基酸的氨基开始,与尿素的羰基进行亲核反应,形成氨基酸尿素中间体;第2阶段反应为分子内部反应,原尿素的氨基与原氨基酸的羰基进行亲核反应而形成环状结构(乙内酰脲环),最终色氨酸、苯丙氨酸与尿素结合形成乙内酰脲环。在氨基酸与尿素反应机制的基础上,推测了蛋白质与尿素的反应机制,第1阶段反应为蛋白质N末端氨基酸的氨基与尿素的羰基进行亲核反应,形成蛋白质尿素中间体;第2阶段反应也是分子内部反应,原尿素的氨基与原氨基酸的羰基进行亲核反应,肽键断裂,N末端的氨基酸形成乙内酰脲环,蛋白质降解1分子氨基酸,蛋白质本身变成比原来少1个氨基酸的蛋白质。

3 结 论

为了高效提取羊毛角蛋白及探究羊毛角蛋白溶于熔融尿素的溶解机制,采用熔融尿素法优化了提取工艺、测定了与熔融尿素作用降解后白蛋白的分子量、分析了白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸与熔融尿素反应的溶解液,得到了以下结论:

①熔融尿素法溶解羊毛的最佳工艺条件:羊毛与尿素质量比1∶12.5、反应温度160 ℃、反应时间20 min,羊毛溶解率为86.32%。随反应温度的上升及反应时间的增加羊毛角蛋白的提取率均降低。

②白蛋白与熔融尿素反应后白蛋白分子量降低,反应时间越长分子量降低幅度越大。

③对比分析白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸与熔融尿素反应溶解液发现,白蛋白透析外液中存在色氨酸与苯丙氨酸,证明了熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸。

④推测羊毛角蛋白与熔融尿素反应的机制为熔融尿素使角蛋白的N端肽键断裂,从角蛋白的N端开始释放氨基酸,最终角蛋白可以降解成较低分子蛋白质、肽、氨基酸。