济川煎干预肠道动力改善慢传输型便秘的机制探究

屈子怡，张雨田,王 红，薛俊丽，戚军明

近年来，便秘在普通人群中的发病率逐年升高，长期便秘会诱发结直肠恶性肿瘤、脑血管意外、心肌梗死等危重疾病[1]。临床上将便秘分为继发性便秘和原发性便秘，原发性便秘又分为功能排便障碍性便秘、慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）和出口梗阻性便秘[2]，其中STC 在原发性便秘中的比例高达45.5%，临床表现为大便困难、大便频率减少、缺乏便意等[3]。临床采用口服泻剂的短期效果较好，但长期服用有不良反应[4]。手术治疗则存在创伤大等缺点[5]。寻求一种安全有效的STC 治疗策略是当前急需解决的问题。已有多项研究证明济川煎对于STC 具有显著疗效[6-7]，但其作用机制尚未明确。

C-Kit 是Cajal 间质细胞（interstial cells of Cajal，ICC）的特异性标志物，ICC 是胃肠道运动慢波的起搏细胞，在胃肠神经系统和平滑肌之间信号传递中扮演重要角色，与STC 发生密切相关[8]。血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）是一种小分子多肽，主要由大脑神经元、胃肠道共同分泌，可松弛平滑肌，抑制胃肠道蠕动和排空，从而引发便秘[9]。本研究使用济川煎干预STC 模型大鼠，观察济川煎对结肠上C-Kit 和血清VIP 的影响，以期为济川煎治疗STC 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠40 只，11～12 周，体质量210～230 g，由斯贝福生物技术有限公司提供[许可证号：SCKX（京）2019-0010]。

1.2 实验药物 济川煎由天津中医药大学第二附属医院药房提供。方剂组成：升麻3 g，当归10 g，枳壳3 g，肉苁蓉9 g，泽泻4.5 g，怀牛膝6 g。生药饮片加入10 倍量的水，浸泡半小时后，将全部药物用沸水煎煮15 min，将药液滤出，再加10 倍水再次煎煮20 min，将两次的滤液混合，冷藏在4 ℃冰箱中保存使用。将复方地芬诺酯研磨成粉末，再和0.9%氯化钠溶液混合制成浓度为1.5 mg/mL 的复方地芬诺酯混悬液。制备碳末糊：将4 g 无水碳末和15 g 羧甲基纤维素钠混合，再加入蒸馏水至300 mL，加热至质地黏稠糊状。

1.3 试剂与仪器 5%无水碳末（天津科密欧化学试剂公司）；羧甲基纤维素钠（天津致远试剂有限公司）；3%戊巴比妥钠（美国Sigma 公司）；高速离心机（力康生物医疗科技控股有限公司）；酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；VIP 及C-Kit 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。

1.4 分组、造模及给药 40 只SD 大鼠先适应性喂养1 周，随机分为正常组、模型组、济川煎高、中、低剂量组，每组8 只。正常组予10 mL/（kg·d）生理盐水连续灌胃14 d；其余组予复方地芬诺酯混悬液10 mL/（kg·d）连续灌胃14 d，建立STC 模型大鼠。于第14 天碳末糊灌胃，记录各组大鼠首粒黑便时间，证实STC 大鼠造模成功，第15 天，分别以1.85 g/kg、3.7 g/kg、7.4 g/kg 的济川煎灌胃，为济川煎低、中、高剂量组，每天1 次，连续14 d。同时正常组、模型组大鼠用相同体积的蒸馏水灌胃。

1.5 取材 造模第28 天，用碳末糊以0.1 mL/10 g灌胃。30 min 后，腹腔内注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg)麻醉，腹部正中切口，腹主动脉取血，静置0.5 h后，使用离心机以3 000 r/min 离心15 min 取得血清，-80 ℃冻存备用。摘除从幽门到直肠末端的全部肠道，轻轻将肠管拉直后，测量各组大鼠幽门括约肌到碳末推进末端距离，然后取中段结肠组织于-80 ℃保存。

1.6 结肠组织C-Kit 含量检测 记录各组大鼠首粒黑便时间、碳末推进长度，取部分大鼠结肠，加入预冷的PBS 缓冲液中超声粉碎以制备结肠组织匀浆，以3 000 r/min 离心15 min 取得上清液，-20 ℃反复冻融3 次，按C-Kit 试剂盒说明进行检测，计算出大鼠结肠组织C-Kit 蛋白含量。

1.7 血清VIP 含量检测 用ELISA 法按VIP 试剂盒说明书要求和步骤检测定血清VIP 含量。

1.8 统计学方法 实验数据用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，使用LSD-t 进行两两比较。以P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠首粒黑便时间比较 与正常组相比，模型组大鼠首粒黑便时间显著增长，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，济川煎中、高剂量组首粒黑便时间下降（P＜0.05）；济川煎高剂量组首粒黑便时间低于济川煎低、中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 大鼠首粒黑便时间、肠道碳末推进长度、VIP、C-Kit 含量比较（n＝8）

2.2 各组大鼠肠道碳末推进长度比较 与正常组比较，模型组大鼠的碳末推进长度明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，济川煎低、中、高剂量组大鼠碳末推进长度均增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；济川煎高剂量组大鼠肠道碳末推进长度较中、低剂量组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠血清中VIP 浓度比较 与正常组相比，模型组大鼠血清中VIP 浓度明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，济川煎低、中、高剂量组血清中VIP 浓度均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；济川煎高剂量组的血清VIP 浓度较中、低剂量组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 各组大鼠结肠组织C-Kit 蛋白含量比较 与正常组比较，模型组大鼠结肠中C-Kit 蛋白含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，济川煎低、中、高剂量组大鼠结肠C-Kit 蛋白含量均上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）；济川煎高剂量组大鼠结肠C-Kit 蛋白含量较中、低剂量组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

济川煎源自《景岳全书》，方中君以肉苁蓉温肾助阳行便；臣以当归、牛膝补血益肾，润燥通便；佐以枳壳消积除满，泄肾浊而利小便；臣以升麻升清阳而浊阴自降。诸药合用共奏温肾益精，润肠通便之功，主治肾阳虚弱，精津不足证，如大便秘结，腰膝酸软，舌淡，苔白，脉沉迟等。临床研究发现中医药治疗便秘有较好疗效[10-11]。虽各代中医典籍中均无“便秘”名称的记载，但在传统理论中已有“脾约”“大便难”等概念，治疗也多立足于“脏腑辨证”[12-13]，临床上也都取得良好疗效[14-15]。STC 的证型多为本虚标实，水谷精微亏虚则不能濡润肠道，正气不足，津液匮乏，无水行舟，导致糟粕留滞于肠内最终出现便秘。因其病机中有精津不足，无水行舟的共性，故用济川煎以温润下行通便治疗STC 较为适宜。现代临床研究也发现济川煎可以有效改善STC 患者的临床症状[16-17]，但其机制仍不清楚。

当肠道运动功能出现障碍，内容物传输延迟，久之则出现STC，因此肠道运动功能下降是STC 出现的主要原因之一，而肠道运动能力与相关神经信号递质、运动信号传递密切相关[18]。课题组前期临床实践中发现济川煎能够较好地改善STC 患者的临床症状。本实验发现，造模STC 模型14 d 后，模型组大鼠出现排便便粒小、便质干、数量较少等情况，且大鼠首粒黑便排出时间长，肠道内碳末推动长度缩短，反映大鼠肠道运动能力减弱[19]，说明成功建立了STC 大鼠模型。采用济川煎干预后，首粒黑便排出时间减少、肠道内碳末推动长度增加，说明济川煎对STC 大鼠的肠道运动功能障碍具有治疗作用。

肠道神经元（enteric nervous system，ENS）通过释放不同的神经递质调控肠道运动，因此肠道神经系统与肠道运动密切相关。根据含有的神经递质不同，肠道神经元可以分为胆碱能神经元、肽能神经元、氮能神经元、5-TH 能神经元等，其中肽能神经元释放的VIP 属于抑制性肠神经递质[20]，它能抑制小肠运动、松弛胃肠道平滑肌，造成胃肠动力障碍[21]。张娟等[22]发现当上调VIP 浓度后，患者的便秘症状明显加重。本研究发现，模型组大鼠血清中VIP 含量明显上升，说明VIP 与STC 的发病有密切联系。经济川煎干预后，大鼠血清VIP 浓度下降，提示济川煎可以降低VIP 的浓度来缓解STC 的症状。

ICC 产生的慢波电信号是肠道机械运动的基础，与胃肠道蠕动功能密切相关[23]。C-Kit 是ICC 的特异性标志物，C-Kit 与干细胞因子SCF 结合后，C-Kit 会被迅速活化，同时激活Ras/Erk 等多个下游信号通路[24]，作用于ICC 以促进其发育、分化、增殖，因此C-Kit 对于维持ICC 的数量、功能起重要作用[25-26]。Tong 等[27]研究发现STC 患者乙状结肠标本C-Kit蛋白和C-Kit mRNA 表达下降，推测C-Kit 表达途径异常可以通过影响ICC 数量和功能进而影响肠道运输功能。Choi 等[28]将C-Kit 基因敲除后发现敲除C-Kit 基因后的大鼠肠道内的ICC 数量明显下降，回、结肠的运动功能均较之前显著减弱。本研究中，模型组大鼠结肠C-Kit 含量明显降低，说明STC的发生与结肠C-Kit 表达水平降低相关。济川煎干预后，大鼠结肠C-Kit 表达上升，提示济川煎可以通过提高结肠C-Kit 表达水平来改善STC 的症状。

综上所述，本研究结果表明济川煎可以促进大鼠肠道运动功能，改善STC，这可能与其能提高结肠上C-Kit 表达、降低血清中VIP 浓度相关，其作用机制有待进一步研究。