胶体金免疫层析试纸定量检测猪肉中沙丁胺醇的研究

宋春美, 崔梦杰, 刘金鑫, 王德国

(许昌学院 食品与药学院;河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室,河南 许昌 461000)

沙丁胺醇是一种肾上腺类β2-受体激动剂,是一种违禁药物[1].沙丁胺醇残留的常见检测方法如色谱法[2]、免疫法[3]、传感器法[4]等,操作过程复杂、对仪器设备要求高.而色谱—质谱法[5]、免疫学和层析技术的结合[6]、传感器和分子技术的结合[7],能提高检测灵敏度、扩大检测范围.因此,需要建立一种简便、灵敏、快速的检测方法.

胶体金免疫层析技术结合了免疫反应和层析原理,具有简单、快速、直观、方便等优点,缺点是肉眼判断具有误差,只能定性检测或半定量检测,且无法对检测结果实时留存[8].胶体金免疫层析技术和便携式免疫层析读条仪的结合能够实现定量检测、实时记录存储和现场高效检测.基于此,以猪肉中的沙丁胺醇为检测对象,用胶体金试纸—读条仪定量检测,为食品中沙丁胺醇的定量检测提供技术借鉴.

1 材料与仪器

材料:沙丁胺醇标准品,坛墨质检—标准物质中心;沙丁胺醇检测卡,深圳市白鳍豚生物科技有限公司;猪肉,胖东来超市、美高美超市、新大新超市.

仪器:ESLR11-MB-6404便携式免疫层析试纸读条仪,德国Qiagen;HC-B3002电子天平,慈溪市华徐衡器实业有限公司;H1850R台式离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;DK-8D水浴锅,常州普天仪器制造有限公司.

2 试验方法

2.1 胶体金试纸的检测步骤及读卡方法

将试纸放在桌面上待测,试纸应即开即用.先向加样孔中滴加2～3滴待测液,然后在3～10 min内用肉眼比色法判断,并记录结果.同时打开便携式免疫层析试纸读条仪的电源,用USB接口衔接电脑,打开LFstudio软件,将试纸在可读值的时间范围内放入试纸卡槽中.在软件中编辑样品信息进行读值.通过软件制作标准曲线后,将其输入读条仪,无需再连接电脑,可携带读条仪进行实时的相关定量检测.

2.2 灵敏度测定

将沙丁胺醇标准品配置成不同浓度的溶液:0、5、10、50、150、250 ng/mL.使用试纸用读条仪读值.

完全抑制浓度:对于定性分析,完全抑制浓度为肉眼观察T线不显示的最低浓度;对于定量分析,使用读条仪扫描读取试纸条信息,完全抑制浓度为T线无强度值时的最低浓度.

肉眼比色检测限:用一系列不同浓度的标准品溶液滴加到试纸,显色结果和滴加水样的试纸进行比较,观察T线显色,肉眼可明显分辨出比水样T线显色弱的最低浓度,为肉眼检测限.

定量检测限:用读条仪重复读6个以上的水样,空白值取T线读值的平均强度值.以IC20为最低检测限,即强度值比空白值弱20%的检测浓度.

绘制标准曲线:在定量检测限与完全抑制浓度之间选择不同浓度的标品溶液进行检测,以强度值为纵坐标,浓度为横坐标,通过读条仪建立标准曲线.

2.3 特异性测定

选择同系物盐酸克伦特罗(1、5 μg/mL)和莱克多巴胺(50、100 μg/mL)检测沙丁胺醇试纸的特异性.以无交叉反应为特异性好.

2.4 添加回收试验

样品预处理:称取阴性猪肉样50 g,绞碎,盛于小烧杯中密封,水浴锅内加热10～15 min,自然冷却后移入离心管内,盖紧管盖放入离心机离心5 min,取出上清液备用.

添加标准品:在可定量检测范围内选择高中低三个添加量.沙丁胺醇的添加量为10、50、150 ng/mL.

测定回收率:通过建立的标准曲线,用读条仪对每个样品进行读值,重复3次,取平均值.计算公式为

回收率=测量浓度值/添加浓度值×100%.

2.5 实际样品检测

在胖东来生活广场、美高美超市和新大新购物广场购买猪肉样品,用免疫层析试纸进行定量检测.

3 结果与分析

3.1 灵敏度测定结果

沙丁胺醇试纸的灵敏度测定结果见图1.当沙丁胺醇的浓度为10 ng/mL时,T线比水样明显变弱,由此判定氯霉素试纸的肉眼检测限为10 ng/mL.肉眼的完全抑制浓度为250 ng/mL.

图1 沙丁胺醇试纸灵敏度测定结果

选取5、50、100、150、200、250 ng/mL的沙丁胺醇标准品浓度绘制标准曲线.试纸检测结果见图2,标准曲线见图3.由图2可知,随着标准品浓度的增加,T线显色越来越浅,有肉眼可见的梯度下降趋势.由图3可知,绘制的标准曲线的方程为Y=-1.8400X+466.6000,R2=0.998 0,说明沙丁胺醇试纸灵敏度较高,在5～250 ng/mL的范围内线性关系良好.在此范围内计算出的最低检测限IC20为5 ng/mL,将试纸放入读条仪可直接读取浓度;当沙丁胺醇浓度大于250 ng/mL时,T线不显色,直接判定为阳性.

图2 用于定量检测的沙丁胺醇试纸检测结果

图3 沙丁胺醇定量检测标准曲线

3.2 特异性测定结果

沙丁胺醇试纸的特异性测定结果如图4所示.可以看出,两种试纸与其同系物均无交叉反应,即试纸不能检测其他β2-受体激动剂,表明试纸的特异性较好.

图4 交叉反应结果

3.3 添加回收实验结果

沙丁胺醇添加量为10、50和150 ng/mL时的回收率分别为87.97 %、110.51 %、118.79 %,平均回收率为105.76 %,具体结果见表1.可以看出,该定量检测方法的回收率较好,而且精密度、准确度较高.

表1 沙丁胺醇添加回收试验

图5 实际猪肉样品检测结果

3.4 实际样品检测

对购买于胖东来生活广场、美高美超市、新大新购物广场的猪肉样品进行检测,均检测3次,代表性结果见图5.可以看出,三种猪肉样品试纸的检测结果均为阴性.说明从三个超市购买的猪肉样品中均不含有沙丁胺醇,食品安全可靠.另外将试纸用读条仪进行读值,结果均为阴性,与肉眼结果一致.建立的定量检测沙丁胺醇的免疫层析试纸技术成功用于实际样品检测.

4 结论

建立了定量检测猪肉中沙丁胺醇的免疫层析试纸方法.该法的定量检测限为5 ng/mL,定量检测范围为5～250 ng/mL,试纸与盐酸克伦特罗和莱克多巴胺无交叉反应.用其检测模拟沙丁胺醇残留的猪肉样品,平均回收率为105.76 %.检测时间为5～10 min,肉眼判定后便可直接机读记录和保存结果.该方法应用前景广阔,可以为新型食品安全快速定量检测技术的研发提供借鉴.