耐盐芽孢杆菌R1 高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

王建荣， 王永华， 祝木金， 王 平， 陈 微， 余 思， 钟 斌

（1. 深圳润康生态环境股份有限公司， 广东 深圳 518102；2. 华南理工大学食品科学与工程学院， 广东 广州 510641；3. 深圳诺普信农化股份有限公司，广东 深圳 518102）

作为一种生物多糖，几丁质来源广泛，据统计，每年自然界产生的几丁质多达数百亿吨[1]。 几丁质由于溶解性太差，限制其产业化应用。 几丁质脱去乙酰基团形成的壳聚糖可以溶于稀酸，提升其应用价值，但是黏度高、溶水性差等缺点还是限制其进一步推广和应用[1]。 壳寡糖作为壳聚糖的降解产物，聚合度一般在2～20，相比于壳聚糖，壳寡糖具有低黏度、良好的水溶性以及生物可降解性等优势[2]。 研究表明，壳寡糖具有抗炎症、抗肿瘤、抑菌、抗氧化等功效，因此可广泛应用于食品、医药、绿色农业种植等领域[3-4]。 目前壳寡糖的制备方式可分为化学法、物理法和酶法三大类，相比另外两种方法，化学法速度快、成本低，因此产业化应用以化学法为主[5]。 随着对壳寡糖研究的深入，越来越多的研究人员提倡酶法制备壳寡糖， 酶法工艺具有绿色环保、反应过程和产物可控、产物结构完好等优势[5]。 但是较高的生产成本限制了酶法工艺的推广应用，因此降低酶法工艺成本，寻找高效壳聚糖酶具有重要意义。

壳聚糖酶能够分解壳聚糖形成壳寡糖，壳聚糖酶来源广泛，已报道的壳聚糖酶主要来源于细菌和真菌。 根据蛋白质结构特性，壳聚糖酶可细分为多个家族，其中46 家族壳聚糖酶因具有催化效率高、反应条件温和等优点，在许多领域具有良好的应用价值[6-7]。46 家族壳聚糖酶主要来源于细菌，迄今，已有多种46 家族壳聚糖酶被分离纯化以及特性表征。 来源于芽孢杆菌的壳聚糖酶作为46 家族重要组成部分， 前期的研究主要集中在萎缩芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌[8-12]，而关于耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶的研究还未有报道。 本研究以前期筛选到的耐盐芽孢杆菌R1 为研究对象， 通过同源克隆获得耐盐芽孢杆菌R1 壳聚糖酶基因（csnbh46），通过毕赤酵母异源表达获得重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶CsnBh46，此外对重组CsnBh46 进行表征分析，为其下一步研究和产业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒以及试剂

耐盐芽孢杆菌R1（分离自土壤，保存于-60 ℃低温冰箱）：作者所在实验室提供；大肠杆菌Top10感受态细胞：宝日医生物技术（北京）有限公司产品；表达载体pPICZαA、毕赤酵母X33：美国赛默飞世尔科技公司产品。

限制性内切酶Sac I、EcoR I、Not I：宝日医生物技术（北京）有限公司产品；Ni-IDA 蛋白质纯化试剂盒：上海生工股份有限公司产品；壳聚糖、氨基葡萄糖、几丁质、木聚糖、羧甲基纤维素钠：上海源叶生物科技有限公司产品；不同聚合度壳寡糖（聚合度2～6）： 惠州长龙生物技术有限公司产品；Silica gel 60 F254 薄层层析硅胶板：德国默克公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

实验过程中所用的培养基主要包括LBZ 培养基、YPDZ 培养基、BMGY 培养基、BMMY 培养基和BSM 培养基，所有培养基的配制均参照前期报道方法[13]。

1.2 仪器与设备

PCR 仪：美国应用生物系统（ABI）公司产品；凝胶成像系统、电转化仪：美国伯乐公司产品；核酸浓度测定仪： 北京百泰克生物技术有限公司产品；7 L发酵罐： 镇江东方生物工程设备技术公司产品；紫外分光光度计：日本岛津公司产品；UltiMate3000 高效液相色谱仪：美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 方法

1.3.1 耐盐芽孢杆菌R1 壳聚糖酶基因克隆及分析将前期保藏于-60 ℃冰箱的耐盐芽孢杆菌R1 取出活化， 以单菌落的形式接入LB 液体培养基进行培养， 吸取50 μL 培养好的菌液，98 ℃热处理5 min后作为PCR 扩增模板。根据耐盐芽孢杆菌KKD1 基因组中假定壳聚糖酶基因序列 （基因登录号：CP054584.1，1 312 385～1 313 226） 设计一对引物（csnbh46-fw：5′-ATGAAAATCAGTTTGGAGAAA-3′和csnbh46-rev：5′-TTATTTGATTACGAAATCACC-3′）用于PCR 扩增。 以处理好的菌液为扩增模板，通过PCR 扩增获得目标产物，通过琼脂糖凝胶电泳对目标PCR 产物进行纯化回收，将纯化回收后的PCR产物送至广州艾基生物有限公司进行测序分析，根据测序结果获得壳聚糖酶基因csnbh46。

1.3.2 耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶CsnBh46 序列分析通过NCBI 数据库完成壳聚糖酶基因csnbh46 序列比对分析；通过expasy 平台提供的软件完成壳聚糖酶CsnBh46 理化性质及基础结构分析；通过在线软件SignalP-5.0 Server 完成信号肽分析；通过在线软件SWISS-MODEL 完成壳聚糖酶CsnBh46 三维建模； 通过软件Autodockviner 完成壳聚糖酶CsnBh46和底物对接分析； 通过软件PyMOL 分析壳聚糖酶CsnBh46 三维结构。

1.3.3 重组工程菌构建及筛选 由于在毕赤酵母X33 中进行重组表达， 因此根据毕赤酵母密码子偏好性进行序列优化。 优化后的基因序列 （命名为csnbh46s， 不含信号肽编码序列） 由通用生物系统（安徽）有限公司合成。合成过程中在csnbh46s 基因序列两端添加EcoR I 和Not I 酶切位点， 此外去掉csnbh46s 基因序列自身终止密码子， 将合成的csnbh46s 基因和载体pPICZαA 进行连接反应，获得表达载体 pPICZαA-csnbh46s。 将表达载体pPICZαA-csnbh46s 用限制性内切酶Sac I 线性化后，转入毕赤酵母X33 感受态细胞中，将转化后的毕赤酵母X33 感受态细胞涂布于YPDZ 固体培养基，30 ℃静置培养。 参照前期报道的方法进行筛选实验[13]，最终确定1 个重组工程菌进行高密度发酵培养。

1.3.4 高密度发酵 高密度发酵培养在7 L 发酵罐中进行，实验过程如下：1）将重组工程菌以单菌落形式接入YPDE 培养基中过夜培养（200 r/min、30 ℃），作为一级种子液；2）将一级种子液按1%的接种体积分数接入含有100 mL YPD 培养基的500 mL 摇瓶中，200 r/min、30 ℃培养至OD600nm值达到6～10；3）将培养好的菌液按照10%的接种体积分数接入7 L 发酵罐中进行培养；4）初始阶段补加甘油作为碳源供菌体生长，当菌体质量浓度（以菌体湿质量计）增加至181 g/L，停止流加甘油，开始补加甲醇进行诱导培养；5）培养过程中每隔24 h 取样进行酶活力、总蛋白质质量浓度以及细胞质量浓度的测定，测定过程和前期报道方法一致[8]。

1.3.5 重组CsnBh46 分离纯化及酶动力学参数测定重组CsnBh46 纯化参照文献[8]的方法进行。 通过超滤管（相对分子质量1.0×104）对高密度发酵上清液进行浓缩。 以浓缩好的酶液为对象，利用Ni-IDA 蛋白质纯化试剂盒获得纯化后重组CsnBh46。 测定重组CsnBh46 对不同质量浓度胶体壳聚糖（1～10 mg/mL）的反应速度，通过软件GraphPad Prism 8.0.2 拟合分析获得相关酶动力学参数，如米氏常数Km、最大反应速度vmax等。

1.3.6 重组CsnBh46 特性测定 重组CsnBh46 最适反应pH 测定如下：在55 ℃、不同pH 条件下（pH 3.5～6.0 时为0.05 mol/L 乙酸乙酸钠缓冲液，pH 6.5～7.0 时为0.05 mol/L 磷酸缓冲液）测定纯化后重组CsnBh46 酶活力，参照前期报道方法[8]计算相对酶活力；pH 稳定性测定如下： 将纯化后重组CsnBh46 在25 ℃、不同pH 条件下（pH 3.0～11.0）处理4 h 后测定剩余酶活力。 重组CsnBh46 最适反应温度测定如下：在pH 6.0 条件下，测定纯化后重组CsnBh46 在不同温度（40～70 ℃）的酶活力，参照前期报道方法[8]计算相对酶活力；将纯化后重组CsnBh46 在45～60 ℃条件下水浴处理30 min 和60 min 后，测定剩余酶活力。不同金属离子对纯化后重组CsnBh46 稳定性影响参照前期报道方法[8]。 以不同脱乙酰度胶体壳聚糖、几丁质、羧甲基纤维素钠、木聚糖为底物，分别测定纯化后重组CsnBh46 酶活力，将测得的最高酶活力设置为100%，计算相对酶活力。

1.3.7 重组CsnBh46 水解特性分析 以5 g/dL 不同聚合度壳寡糖（壳二糖至壳六糖）为底物，参照前期报道的方法[8，14]研究重组CsnBh46 水解特性。

1.3.8 不同聚合度壳寡糖可控性制备 以脱乙酰度95%胶体壳聚糖为底物，通过重组CsnBh46 可控性制备不同聚合度壳寡糖。 首先， 摸索不同重组CsnBh46 添加量（5～25 U/mL）对不同质量浓度胶体壳聚糖（1～3 g/dL）的水解效果。 总反应体系为10 mL，在55 ℃、100 r/min 反应1 h 后取样进行分析。 其中水解率和产物组成测定均参照前期报道方法[15-16]。其次，在55 ℃、100 r/min 条件下，以质量浓度3 g/dL胶体壳聚糖为底物， 重组CsnBh46 添加量为10 U/mL， 解析反应过程中水解率和产物组成动态变化。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖酶基因csnbh46 序列分析

结合测序结果以及NCBI 比对分析， 发现csnbh46 基因全长837 bp，编码278 个氨基酸。通过软件ProtParam 预测，CsnBh46分子式为C1390H2172N382O426S8，蛋白质相对分子质量为31 300。 NCBIblastp 比对结果显示CsnBh46 与枯草芽孢杆菌壳聚糖酶（WP_133486751.1）相似性为93.1%，与萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶 （WP_088117259.1） 相似性为91.2%。NCBIblastp 比对结果表明CsnBh46 属于糖苷水解酶46 家族。 将CsnBh46 与已经获得晶体的壳聚糖酶（包括链霉菌174 壳聚糖酶Csn174，P33665.1；链霉菌SirexAA-E 壳聚糖酶Csn5457，AEN13266.1；环状芽孢杆菌壳聚糖酶CsnBac，P33673.2； 枯草芽孢杆菌壳聚糖酶CsnMY002，WP_148982050.1）进行比对分析，实验结果如图1 所示。 虽然不同微生物来源的壳聚糖酶氨基酸序列差异性大，但是酶催化活性位点高度保守，根据比对结果以及之前的文献报道[17]，推测第55 位的谷氨酸和第71 位的天冬氨酸为CsnBh46 催化活性位点。此外，SignalP-5.0 Server 预测CsnBh46 前36 个氨基酸为其潜在信号肽序列。

图1 壳聚糖酶CsnBh46 与46 家族壳聚糖酶蛋白质比对分析Fig. 1 Protein comparative analysis of chitosanase CsnBh46 and glycoside hydrolase family 46

以枯草芽孢杆菌壳聚糖酶CsnMY002 （PDB 登录号为7C6C） 为模板， 通过在线软件SWISSMODEL 建模，获得CsnBh46 三维构象（见图2（a））。和已报道的壳聚糖酶一致[18]，CsnBh46 三维结构呈球状，主要由α 螺旋构成，其中α2～α4 构成上半球；下半球主要有α1、α6～α9 和2 个β 折叠构成； 上下两个半球由长螺旋α5 连接。 CsnBh46 和壳六糖分子对接由Autodockviner 完成。 由图2（b）可知，CsnBh46 底物结合区域呈孔洞状态， 壳六糖被包裹在底物结合区域。 由图2（c）可知，CsnBh46 底物结合区域与壳六糖之间的作用力主要是氢键，其中多个关键氨基酸在水解过程中发挥重要作用。

图2 壳聚糖酶CsnBh46 结构分析Fig. 2 Structure analysis of chitosanase CsnBh46

2.2 重组工程菌构建及筛选

由于在毕赤酵母X33 中进行重组表达，因此选择毕赤酵母最经典的α 信号肽替代CsnBh46 自身信号肽。 此外通过分析，发现耐盐芽孢杆菌和毕赤酵母密码子偏好性存在差异，因此需要根据毕赤酵母密码子偏好性进行序列优化。 通过密码子优化，将原始基因csnbh46 的GC 含量由45.1%提升至48.2%， 更接近毕赤酵母高效表达最适范围 （约50%），密码子适用指数（CAI）由0.62 提升至0.78，整个过程对179 个碱基进行了优化（见图3）。 优化后的基因连接至载体pPICZαA， 获得表达载体pPICZαA-csnbh46s。将表达载体pPICZαA-csnbh46s线性化后转入毕赤酵母X33 获得多个重组转化子。初步筛选挑取96 个转化子，通过酶活力测定分析，最终选取3 个高酶活力重组工程菌 （分别命名为bh-5、bh-65 和bh-73）进行复筛。 复筛采用摇瓶培养，诱导时间均为120 h，摇瓶复筛结果显示重组工程菌bh-5 发酵酶活力最高（125 U/mL），其次为bh-73（105 U/mL）和bh-65（101 U/mL）。

图3 csnbh46 基因密码子优化序列分析Fig. 3 Sequence analysis of optimized and native gene of csnbh46

2.3 重组工程菌高密度发酵

选取重组工程菌bh-5 进行高密度发酵， 实验在7 L 发酵罐中进行。 由图4（a）可知，在诱导培养168 h 后，重组工程菌bh-5 的酶活力、总蛋白质质量浓度和细胞质量浓度均达到最高， 分别为6 375 U/mL、4.3 g/L 和465 g/L。 相比摇瓶培养，重组工程菌bh-5 在7 L 发酵罐发酵后的酶活力提升了50倍。由图4（b）可知，发酵上清液中存在两条主要蛋白质条带，相对分子质量分别约为3.3×104和2.7×104，推测相对分子质量3.3×104条带是由蛋白质翻译过程中糖基化形成的。 由图4（c）可知，重组CsnBh46去糖基化后只剩下一条相对分子质量约为2.7×104的条带，表明重组CsnBh46 存在糖基化修饰。此外发酵上清液中基本为重组CsnBh46（见图4（b））。

图4 重组菌bh-5 在7 L 发酵罐发酵曲线及不同样品SDS-PAGE 蛋白质电泳Fig. 4 Fermentation curve and SDS-PAGE analysis of different samples of recombinant strain bh-5 cultivated in 7 L bioreactor

2.4 分离纯化、酶动力学参数及底物特异性测定

通过实验获得纯化重组CsnBh46， 纯化后的重组CsnBh46 酶比活为2 310 U/mg，重组CsnBh46 酶反应动力学参数如表1 所示。重组CsnBh46 米氏常数Km为0.75 mg/mL， 表明重组CsnBh46 对壳聚糖具有良好的亲和力。 最大反应速度vmax为2 513 μmol/（L·min·mg）， 表明重组CsnBh46 能够高效水解壳聚糖。

表1 重组CsnBh46 酶动力学参数Table 1 Kinetic parameters of recombinant CsnBh46

2.5 温度特性

重组CsnBh46 温度特性如图5 所示，由图5（a）可知，重组CsnBh46 最适反应温度为60 ℃，在50～65 ℃时相对酶活力均大于80%。 由图5（b）可知，重组CsnBh46 在45～55 ℃时具有良好的稳定性，水浴处理1 h 后，剩余酶活力均大于80%，当处理温度大于55 ℃，剩余酶活力急剧下降，重组CsnBh46 在60 ℃水浴处理1 h 后，剩余酶活力仅为11%。 有研究报道萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶Csn-SH[18]、解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶BaCsn46A[15]和BaCsn46B[11]，在55 ℃热处理30 min 后， 剩余酶活力分别为7%、31%和60%。 相比于上述芽孢杆菌壳聚糖酶， 重组CsnBh46 具有更好的热稳定性。

图5 温度对重组CsnBh46 的影响Fig. 5 Effect of temperature on recombinant CsnBh46

2.6 pH 特性

重组CsnBh46 的pH 特性如图6 所示， 由图6（a）可知，重组CsnBh46 最适反应pH 为6.0。 由图6（b）可知，重组CsnBh46 在pH 6.0～8.0 时具有良好的稳定性， 室温放置4 h 后， 剩余酶活力均大于80%。 重组CsnBh46 的pH 特性与已报道的吉氏菌壳聚糖酶相似[19]。

图6 重组CsnBh46 最适反应pH 和pH 稳定性Fig. 6 Optimal reaction pH and pH stability of recombinant CsnBh46

2.7 金属离子特性

不同金属离子对重组CsnBh46 稳定性影响如表2 所示。 Mn2+、Mg2+和Ca2+对重组CsnBh46 具有激活作用， 其中Mn2+效果最好。 在1 mmol/L 条件下，Mn2+、Mg2+和Ca2+处理组剩余酶活力分别为145.2%、111.5%和115.5%；在5 mmol/L 条件下，Mn2+、Mg2+和Ca2+处理组剩余酶活力分别为164.8%、118.6%和123.2%。 金属离子Cu2+、Fe2+和Co2+对重组CsnBh46具有抑制作用，其中Fe2+的影响最大。当离子浓度为1 mmol/L 和5 mmol/L 时，Fe2+处理组的剩余酶活力分别仅为26.6%和8.5%。

表2 不同金属离子对重组CsnBh46 稳定性影响Table 2 Effects of different metal ions on the stability of recombinant CsnBh46

2.8 底物特异性

重组CsnBh46 底物特异性如表3 所示， 重组CsnBh46 只对胶体壳聚糖具有水解活性， 其中对脱乙酰度95%胶体壳聚糖表现出最高水解活性。 重组CsnBh46 对粉末几丁质、胶体几丁质、羧甲基纤维素钠以及木聚糖均没有活性。

表3 重组CsnBh46 底物特异性Table 3 Substrate specificity of recombinant CsnBh46

2.9 水解特性

重组CsnBh46 水解不同聚合度壳寡糖实验结果如图7 所示，重组CsnBh46 对壳二糖和壳三糖没有水解活性，反应2 h 后，壳二糖和壳三糖均没有被分解成更小的糖。 重组CsnBh46 对壳四糖水解活性较弱，反应2 h 后，少量壳四糖被转化为壳二糖。 重组CsnBh46 对壳五糖和壳六糖具有良好的水解活性， 反应1 h 后， 壳五糖全部转化为壳二糖和壳三糖，壳六糖则全部转化为壳二糖、壳三糖和壳四糖。在所有的反应过程中均没有出现单糖， 表明重组CsnBh46 是一种内切壳聚糖酶。此外，在所有的反应体系中均没有出现比初始底物聚合度更高的壳寡糖，表明重组CsnBh46 不具有转糖苷酶活性。

图7 重组CsnBh46 水解不同聚合度壳寡糖产物分析Fig. 7 Analysis of the hydrolysis products from differently polymerized chitosan oligosaccharides hydrolyzed by recombinant CsnBh46

2.10 重组CsnBh46 水解壳聚糖制备不同聚合度壳寡糖

不同酶添加量对不同质量浓度（1～3 g/dL）底物的水解效果如图8 所示。底物质量浓度为1 g/dL、酶添加量在5～20 U/mL 时，反应1 h 后，水解产物主要由壳二糖和壳三糖构成，含有少量壳四糖；当酶添加量为25 U/mL 时，水解产物则基本为壳二糖和壳三糖（见图8（a））。 底物质量浓度2 g/dL 和3 g/dL的水解结果相似， 当酶添加量为5～10 U/mL 时，水解产物主要为壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖，包含少量壳六糖；当酶添加量大于10 U/mL，水解产物则主要由壳二糖、壳三糖和壳四糖构成（见图8（b）和图8（c））。

图8 重组CsnBh46 水解不同质量浓度胶体壳聚糖产物TLC 分析Fig. 8 TLC analysis of products from different concentration of colloidal chitosan catalyzed by recombinant CsnBh46

根据不同酶添加量水解不同质量浓度胶体壳聚糖实验结果，进一步研究10 U/mL 酶添加量水解3 g/dL 胶体壳聚糖反应过程中产物组成和水解率，实验结果如图9 所示。 反应15 min 后，水解产物由壳二糖至壳六糖构成（见图9（a）），其中壳三糖、壳四糖、 壳五糖和壳六糖的质量浓度分别为6.32、7.12、6.51、5.32 mg/mL（见图9（b）），水解率达到92.5%（见图9（c））。 反应30 min 后，壳五糖和壳六糖的质量浓度逐渐降低，壳二糖、壳三糖和壳四糖的质量浓度以及水解率逐渐增加（见图9）。 反应至45 min 和60 min 时，水解产物主要由壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖构成。

图9 不同反应时间下重组CsnBh46 水解3 g/dL 胶体壳聚糖的水解产物TLC 分析、壳寡糖质量浓度以及水解率Fig. 9 TLC analysis of products, mass concentration of chitosan digosaccharides and hydrolysis rate of 3 g/dL colloidal chitosan hydrolyzed under different reaction time by recombinant CsnBh46

迄今，已有多种酶用于制备壳寡糖，根据酶的种类可以分为专一性酶（壳聚糖酶）和非专一性酶（包括果胶酶、纤维素酶、脂肪酶等）。 由表4 可知，壳聚糖酶水解效率明显优于非专一性酶，此外重组CsnBh46 水解效率优于已报道的多种壳聚糖酶。

表4 酶法制备壳寡糖Table 4 Chitosan oligosaccharides prepared by enzymatic methods

3 结 语

通过同源克隆获得耐盐芽孢杆菌R1 壳聚糖酶基因csnbh46，该基因全长为837 bp，编码278 个氨基酸，其中前36 个氨基酸为其潜在信号肽序列，序列比对结果表明壳聚糖酶CsnBh46 属于糖苷水解酶46 家族。 以毕赤酵母X33 为宿主，重组表达壳聚糖酶CsnBh46， 在7 L 发酵罐条件下， 重组工程菌bh-5 最高酶活力为6 375 U/mL。此外通过蛋白质纯化以及酶动力学参数测定发现重组CsnBh46 米氏常数Km为0.75 mg/mL，最大反应速度vmax为2 513 μmol/（L·min·mg）， 表明重组CsnBh46 对壳聚糖具有良好的亲和力和水解活性。重组CsnBh46 在45 ～55 ℃具有良好的活性和稳定性。重组CsnBh46 水解特性表明其是一种内切壳聚糖酶。 重组CsnBh46 能够高效水解3 g/dL 胶体壳聚糖， 酶添加量10 U/mL条件下， 反应15 min 壳聚糖水解率便达到92.5%，表明重组CsnBh46 适用于壳寡糖的酶法制备，为CsnBh46 下一步产业化应用奠定基础。