青岛近海球形棕囊藻的宏条形码分析*

王一奇 丁翔翔 宋会银 陈楠生

(1.中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室 山东青岛 266071; 2.崂山实验室 海洋生态与环境科学功能实验室 山东青岛 266237; 3.中国科学院海洋大科学研究中心 山东青岛 266071; 4.中国科学院大学 北京 100049; 5.江汉大学 湖北武汉 430056)

隶属于定鞭藻门(Haptophyta) 的棕囊藻属(PhaeocystisLagerheim)物种在包括极地和温带海域在内的全球海域广泛分布, 既是重要的初级生产者,也是构成海洋生态系统的基础, 为浮游动物提供食物(齐雨藻等, 2001)。棕囊藻属物种具有重要的生态功能, 不仅能够合成和降解二甲基巯基丙酸(DMSP),释放二甲基硫(DMS)在气候调节中起重要作用(沈萍萍等, 2018), 而且可以引起赤潮, 在包括欧洲北海沿岸海域、荷兰沿海、挪威海等海域频繁暴发, 产生灰白色泡沫, 给海洋环境和渔业造成极大危害(齐雨藻等, 2002)。自1997 年10 月球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)赤潮首次在我国东南沿海海域大规模暴发以来, 球形棕囊藻赤潮在包括福建、广东、广西、海南、河北及天津等省市海域在内的多个海域都频繁暴发(Wanget al, 2021)。

由于球形棕囊藻具有复杂的异型生活周期(heteromorphic life cycle), 既包括游离具有鞭毛的单细胞形态, 也具有囊体形态, 不同形态具有不同的生理和生态特征(Rousseauet al, 2007; Wanget al, 2021),加上球形棕囊藻细胞很小(直径约3～9 μm), 增加了基于形态特征的检测和鉴定的难度。1997 年球形棕囊藻赤潮首次在我国海域暴发时, 曾经根据其形态特征鉴定为波切棕囊藻(Phaeocystis pouchetii) (何家菀等, 1999), 后来通过分子生物学方法确认为球形棕囊藻(王宁等, 2000), 表明分子生物学方法的辅助鉴定大大提升了鉴定的敏感性和准确性。在球形棕囊藻赤潮首次在我国海域暴发时, 赤潮原因种曾被鉴定为一个新纪录种(陈菊芳等, 1999)。不过由于其细胞小,在浮游植物调查研究中可能被忽视, 因此并不能排除它本来就是我国海域的一个常见物种, 只是长期没有得到准确鉴定。

基于通用分子标记扩增子高通量测序的宏条形码分析(metabarcoding analysis)越来越广泛地应用于鉴定特定海洋生态环境中浮游植物的组成并跟踪浮游植物的时空动态变化(陈楠生, 2020)。与其他种类分子标记相比, 针对海洋浮游植物和赤潮物种的宏条形码分析中应用最多的分子标记18S rDNA V4 具有较高的分辨率, 其长度(～380 bp)也适于DNA 二代测序技术, 而且参考序列最丰富(Guillouet al, 2013)。不过, 由于包括球形棕囊藻在内的定鞭藻物种的18S rDNA 均具有较高的GC 含量, 使得基于不同引物的PCR 扩增结果出现了不利于定鞭藻物种的扩增偏好性, 导致宏条形码分析容易遗漏掉大量的定鞭藻物种(Liuet al, 2009)。这些研究表明扩增引物的选择对针对定鞭藻物种的宏条形码分析的重要性。为了评估18S rDNA V4 不同扩增引物对球形棕囊藻宏条形码分析结果的影响, 我们利用青岛栈桥海域的水样, 比较分析了18S rDNA V4 扩增引物对宏条形码分析结果的影响。本研究比较分析了18S rDNA V4 两组常用扩增引物: (1) 由Stoeck 等开发的扩增引物(简称Stoeck 引物), 包括 V4F: CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC 和V4R: ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A (Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021); (2) 由宋伦等开发的扩增引物(简称Song 引物), 包括V4-F:GCGGTAATTCCAGCTCCAAT 和V4-R: GATCCCC HWACTTTCGTTCTTGA(宋伦等, 2016)。除此之外,还比较分析了2021 年冬季青岛近岸海域(西海岸)首次暴发的球形棕囊藻赤潮(Liet al, 2022; Songet al,2022; 张清春等, 2022)样本的球形棕囊藻及其时间动态变化。

1 材料与方法

1.1 样品采集

为了比较分析通用分子标记18S rDNA V4 的扩增引物选择对针对球形棕囊藻的宏条形码分析结果的影响, 我们在青岛栈桥海域系统开展了时间序列的采样。从2021 年9 月1 日至30 日, 于青岛栈桥定点(图1)完成了30 天不间断的连续逐日采样。采集时间为每天上午10 点, 每次采集表层海水5 L, 采用200 μm 筛绢于现场完成藻细胞过滤, 去掉大型的浮游动物和浮游植物, 保留藻细胞样本, 带回实验室进行第2 次过滤, 采用0.2 μm 的聚碳酸酯膜(Millipore,USA) 对1.5 L 海水进行过滤, 携带藻细胞的滤膜迅速放入液氮罐中冷冻保存。除了采集藻细胞, 还于现场完成了温度和盐度的测量, 并于实验室完成了对海水样本进行叶绿素和营养盐测量(附表1)。

图1 本研究采样位点示意图Fig.1 Locations of sampling sites in this study

青岛近海于2021 年冬季(12 月)突然暴发了一次球形棕囊藻赤潮, 我们对此赤潮事件也进行了时间序列的采样。采样站位位于青岛鲁海丰海洋牧场(图1),共完成了7 次采样, 包括12 月3 日、12 月8 日、12月11 日、12 月16 日、12 月21 日、12 月26 日和12月31 日采样。赤潮暴发期间, 海水中的球形棕囊藻囊体很多, 肉眼可见(附图1), 最后一次采集样品时肉眼可见的囊体很少且没有完整的形态。每次采集1.5 L 表层海水, 为避免过滤掉囊体, 现场直接采集表层海水, 未经筛娟过滤, 后续的采样流程与青岛栈桥海域时间序列的采样流程相同。

1.2 DNA 提取、PCR 扩增与测序

滤膜细胞的DNA 提取方法参照文献(Liuet al,2020)。为了比较由于引物选择对分子标记18S rDNA V4 扩增结果的影响, 分别利用Stoeck 引物和Song 引物对栈桥海域样本的DNA 进行了扩增。

针对西海岸赤潮海域样本, 利用Song 引物进行了扩增。

扩增结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物的长度, 检测合格后将产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司, 使用 Illumina 公司 TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建库试剂盒进行文库的构建, 构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测, 合格后, 使用NovaSeq 6000 PE250 模式进行上机测序。

1.3 生物信息学分析

利用R 包DADA2 对扩增子测序结果展开宏条形码分析(Callahanet al, 2016, 2017), 分析参数设置如下: maxEE = c (2,2), minLen = 200, truncLen = c(220,220), minBoot = 80, and Min overlap = 12。运行得到ASV 丰度信息以及各个ASV 的PR2注释结果。为保证各样本测序深度的可比性, 使用R 包Vegan(Dixon, 2003)按照ASV 丰度表格中样本的最低数据量抽平, 并采用0.01%的阈值进行丰度筛选。接着对各个ASV 进行进一步的blastn 注释, 设置PID 大于99%, Coverage 大于95%, 合并PR2注释结果和blastn注释结果。通过Mega 11.0 软件的最大似然法构建了ASV 和代表序列之间的遗传进化树(Tamuraet al,2021), Bootstrap 值为1 000。各ASV 之间的TCS 遗传网络图是借助PopART v1.7 构建的(Leighet al,2015)。利用R 包corrplot (Weiet al, 2017)和psych(Revelle, 2021)完成了ASV 与环境因子的相关性分析。利用R 包Vegan (Dixon, 2003)完成了对测序数据的稀释曲线分析。

1.4 基于18S rDNA V4 的遗传多样性分析

把从宏条形码分析结果中筛选出注释为球形棕囊藻的18S rDNA V4 ASV 序列, 以及从不同海域分离到的代表性球形棕囊藻株系的18S rDNA V4 序列一起构建系统发育树。这些代表性球形棕囊藻株系包括: CNS00062(北部湾)、CNS00063(北部湾)、CNS00069(北部湾)、CNS00073(北部湾)、CNS00076(北部湾)、CNS00082(越南)、CNS00093(越南)、CNS00254(越南)、CNS00079(泰国)、CNS01609(青岛西海岸赤潮暴发海域)和Pg-G(A) (欧洲北海)。

2 结果

2.1 评估18S rDNA V4 扩增引物对球形棕囊藻宏条形码分析结果的影响

本研究中, 每一个样本的18S rDNA V4 扩增子通过二代测序获得约5 万条reads (图2)。稀释曲线分析(附图2a, 2b)表明测序深度基本达到饱和, 足够用于分析样本中浮游植物的组成。通过对不同扩增引物(Stoeck 引物和Song 引物)获得的测序结果进行宏条形码分析, 获得了绿藻, 隐藻, 甲藻, 定鞭藻等浮游植物门的组成信息(图2)。利用Stoeck 引物(Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021)的扩增结果开展宏条形码分析获得的甲藻门(Dinoflagellata)、棕鞭藻门(Ochrophyta,包 括 硅 藻) 、 定 鞭 藻 门(Haptophyta) 、 绿 藻 门(Chlorophyta)和隐藻门(Cryptophyta)的ASV(amplicon sequence variant, 扩增子序列变异)数目分别为479、244、0、43 和21 个; 利用Song 引物(宋伦等, 2016)的扩增结果开展宏条形码分析获得的甲藻门、棕鞭藻门、定鞭藻门、绿藻门和隐藻门分别为581、293、76、49 和26 个。比较两种引物的分析结果发现差异主要体现在定鞭藻门上, 利用Stoeck 引物的宏条形码分析没有发现任何鉴定为定鞭藻门的ASV, 而利用Song 引物的宏条形码分析发现了76 个鉴定为定鞭藻门的ASVs (图3a, 3c)。因此, Song 引物能够更好地实现对18S rDNA V4 的扩增, 从而能够更好地扩增出定鞭藻物种, 更适于针对定鞭藻的宏条形码分析。

图2 栈桥海域样本的宏条形码分析流程Fig.2 Metabarcoding analysis of the samples collected in Zhanqiao Pier, Qingdao

2.2 宏条形码分析可以成功鉴定球形棕囊藻并且能够鉴定球形棕囊藻的遗传多样性

通过对青岛栈桥海域的30 个逐日样本的宏条形码分析得到的全部ASVs 进行物种注释, (图4a)发现了两个ASVs (ASV_2 和ASV_6)注释为球形棕囊藻,这两个ASVs 可能代表两个球形棕囊藻株系。这两个ASVs 在所有30 个栈桥海域样本中都出现了(图5d, 5e,5f), 并且具有相对稳定的水平, 表明青岛海域中存在球形棕囊藻, 并且存在一定的遗传多样性, 是青岛近海的本地株系。本研究表明Song 引物不仅可以成功扩增球形棕囊藻的18S rDNA V4, 并且扩增结果可以揭示球形棕囊藻的遗传多样性。

图4 球形棕囊藻ASVs 之间的遗传多样性及其与环境因子相关性分析Fig.4 TCS network display of ASVs annotated as P. globosa and their correlation with environmental factors

利用Song 引物对青岛近海2021 年冬季(12 月)突发性球形棕囊藻赤潮暴发期间采集的时间序列样本的宏条形码分析也发现了这两个ASVs 的信息, 并且比较分析发现两种ASVs 的相对丰度显示出不同的时间变化规律(图5)。在从青岛西海岸球形棕囊藻赤潮暴发过程中采集到的样本中, ASV_2 代表的球形棕囊藻株系在赤潮暴发高潮期间的相对丰度较高, 并在赤潮暴发过程中显示出较强的丰度变化, 随着赤潮的消退逐步降低(图5a)。与ASV_2 代表的株系相比, ASV_6 代表的球形棕囊藻株系的相对丰度较低,并在赤潮暴发过程中显示出较弱的丰度变化, 基本维持在接近本底的水平(图5b)。此外, 在球形棕囊藻赤潮暴发高峰时ASV_2 的丰度也高于ASV_ 6(图5c)。这说明以ASV_2 和ASV_6 为代表的两类球形棕囊藻在西海岸赤潮暴发中扮演着不同的角色: 以 ASV_2 为代表的球形棕囊藻随着西海岸赤潮暴发呈现出先增加后减少的趋势, 且在西海岸赤潮起主要作用, 而以 ASV_6 为代表的球形棕囊藻变化较小。ASV_2 和ASV_6 与青岛海域的环境因子的相关性分析(图4b)表明, 与ASV_6 相比, ASV_2 与海水温度呈显著负相关(P<0.01), 说明ASV_2 代表的是一类耐低温的球形棕囊藻株系, 在环境条件适宜时造成此次赤潮暴发。

2.3 基于18S rDNA V4 的球形棕囊藻遗传多样性分析

前期的研究表明球形棕囊藻具有较高的遗传多样性(Songet al, 2020, 2021, 2022; Wanget al, 2021)。为了探索本研究中发现的ASV_2 和ASV_6 所代表的球形棕囊藻与前期报道的球形棕囊藻的遗传多样性之间的关系, 我们将ASV_2 和ASV_6 序列与11 株从不同海域分离的球形棕囊藻株系的18S rDNA V4序列进行了遗传进化分析(图6)。发现这些18S rDNA V4 序列可以聚成两个不同的分支, 球形棕囊藻代表性株系的18S rDNA V4 序列要么与ASV_2 聚在一起,要么与ASV_6 聚在一起(图6), 表明根据18S rDNA V4 可以将球形棕囊藻株系区分为两类。此外, ASV_2序列还与CNS01609 株系(在青岛西海岸赤潮暴发海域分离)聚在一起。本研究表明, 宏条形码分析中常用的通用分子标记(即可以用于扩增广谱性物种)18S rDNA V4 不仅可以鉴定到球形棕囊藻, 还可以用于初步区分球形棕囊藻的遗传差异。

图6 基于通用分子标记18S rDNA V4 序列的遗传进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of the common molecular marker 18S rDNA V4

3 讨论

3.1 通用分子标记18S rDNA V4 的PCR 扩增引物选择对宏条形码分析结果的准确性很重要

通过比较针对分子标记18S rDNA V4 的两套不同PCR 扩增引物(即Stoeck 引物和Song 引物)发现,这两套针对18S rDNA V4 的扩增引物得到的宏条形码分析结果显示出巨大不同。尽管基于两套引物的宏条形码分析均鉴定出大部分门类的浮游植物组成,包括甲藻、棕鞭藻、绿藻和隐藻(图3)。然而只有基于Song 引物的宏条形码分析获得了定鞭藻信息(76个ASVs), 基于Stoeck 引物的宏条形码分析没有检测到任何定鞭藻信息。本研究结果与宋伦等(2016)的分析结果基本相符。此外, 本研究结果进一步明确了18S rDNA V4 扩增引物的选择对研究结果的准确性很重要。

3.2 青岛近岸海域存在当地球形棕囊藻株系

本研究发现在青岛近岸海域中可以鉴定到球形棕囊藻信息, 并且该分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果(附图1)相符, 因球形棕囊藻单细胞尺寸很小, 分子生物学的快速鉴定显示出方法的优势。此外,针对野外样本的宏条形码分析得到的球形棕囊藻序列ASV_2 与2021 年冬季青岛西海岸球形棕囊藻赤潮暴发海域分离到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列完全一致(图6), 进一步证实青岛近岸海域存在本底球形棕囊藻株系。不仅如此, 经分子生物学鉴定分析发现在青岛栈桥海域和西海岸赤潮暴发海域中均出现了两类不同的球形棕囊藻株系(即由ASV_2 和ASV_6 代表的两类株系)。ASV_2 和ASV_6在2021 年9 月栈桥海域的整月采样过程中相对比较稳定, 没有受到潮汐的显著影响(图5)。利用 18S rDNA V4 (Liuet al, 2020)针对2019 年1 月胶州湾海域样本的宏条形码分析以及利用高分辨率分子标记pgcp1(Songet al, 2020, 2022)和cox1(Songet al, 2021,2022)针对2019 年1 月胶州湾海域样本的分子分析也鉴定到球形棕囊藻的存在, 与本研究结果相符, 表明青岛海域不仅存在本底球形棕囊藻, 还具有一定的遗传多样性。

3.3 不同球形棕囊藻株系对青岛海域突发性赤潮具有不同的贡献

本研究基于18S rDNA V4 的宏条形码分析发现,于2021 年冬季(12 月)在青岛近海突然暴发的球形棕囊藻赤潮样本中可以分辨出两个主要 ASVs, 即ASV_2 和ASV_6。其中ASV_2 的相对丰度较高, 并随赤潮的变化呈现显著的动态变化, 随着赤潮消退呈现下降趋势(图5)。说明造成此次赤潮的致灾基因型是以ASV_2 所代表的这类球形棕囊藻株系。由此可以判断, 不同株系对球形棕囊藻赤潮的形成具有不同的贡献。从该赤潮暴发海域分离到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列与ASV_2 序列在系统发育树中聚在一起(图6), 表明代表ASV_2 的球形棕囊藻株系在赤潮样本中大量存在。

4 结论

18S rDNA V4 是迄今宏条形码分析中最常用的分子标记(陈楠生, 2020)。本研究比较了两对不同的18S rDNA V4 引物在扩增球形棕囊藻时的差别, 包括常用引物(即Stoeck 引物)和球形棕囊藻特异性引物(即Song 引物)。比较分析表明在展开宏条形码分析时, 选择合适的引物对于分析结果至关重要。宏条形码分析结果表明, 青岛近岸海域存在本底球形棕囊藻, 尽管相对丰度不高, 但是具有一定的遗传多样性,主要有两种, 分别由ASV_2 和ASV_6 所代表。其中ASV_2 所代表的球形棕囊藻株系更可能是造成此次赤潮暴发的致灾基因型, 表明不同球形棕囊藻株系在球形棕囊藻赤潮暴发过程中的贡献不同。此外, 两种代表ASVs 与环境因子的相关性分析表明, ASV_2所代表的球形棕囊藻株系与温度呈显著负相关。本研究表明利用Song 引物扩增分子标记18S rDNA V4 在鉴定其他大量浮游植物的同时, 不仅可以检测到青岛近岸海域存在本底球形棕囊藻, 还可以鉴定出2 种基因型的球形棕囊藻(ASV_2 和ASV_6)。因此, 在考虑选择合适的引物开展针对球形棕囊藻以及其他定鞭藻的宏条形码分析时, 建议选择Song 引物(宋伦等,2016)开展基于18S rDNA V4 的宏条形码研究。不过,如果研究目标只是球形棕囊藻的遗传多样性, 可以选择利用高分辨率分子标记pgcp1(Songet al., 2020)或cox1(Songet al., 2021)。