中国南方154份梨地方品种基于SSR标记的遗传多样性与群体结构分析

齐 丹,曹玉芬,胡红菊,张小双,田路明,董星光,张 莹,霍宏亮,徐家玉,刘 超,詹俊宇,张思梦

(1 中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室,辽宁兴城,125100;2 湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉,430064)

梨属(PyrusL.)属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)或梨亚科(Pomoideae)。我国是梨起源中心,也是栽培梨多样性中心之一。我国梨栽培品种主要以传统地方品种为主,约占栽培总面积的60%[1]。梨地方品种在经过复杂的地理环境适应和长期的人工选择后,具有丰富的遗传多样性,是各具特色的一类品种。适于原产地的地方品种是梨种质资源保存和改良的重要资源,深入了解梨地方品种的遗传多样性和遗传变异,对于梨种质资源多样性的保护和重要农艺性状的遗传改良具有重要意义。

随着分子生物技术的快速发展,分子标记技术成为评估种质资源遗传差异和鉴定亲缘关系的有效手段。Yamamoto等[2]最早开发了梨基因组的SSR(simple sequence repeats,简单重复序列)引物;在梨基因组测序完成后,开发出了更多的梨基因组SSR引物[3]。SSR引物在梨属植物的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析、群体结构分析、遗传连锁图谱构建等方面得到应用[4-13]。

本研究利用均匀分布在梨染色体上的17对荧光SSR引物,使用分辨率高、重复性好、灵敏度高的毛细管电泳进行检测[14],对保存于国家果树种质兴城梨、苹果圃和国家果树种质武昌砂梨圃的154份梨地方品种进行遗传背景分析,探讨遗传多样性水平和群体遗传结构,为梨地方品种的收集、保存、指纹图谱构建和分子辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料保存在国家果树种质兴城梨、苹果圃和国家果树种质武昌砂梨圃的起源于12个省区的梨地方品种154份,其中,湖北13份,湖南7份,云南19份,四川29份,贵州7份,安徽9份,江苏9份,江西15份,浙江13份,福建11份,广西13份,广东9份,具体见表1。

1.2 DNA提取及PCR扩增DNA提取:采用改良CTAB法提取叶片DNA,经浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,通过Nano-200(奥盛仪器有限公司,杭州)微量分光光度计检测将浓度稀释至50 ng/μL备用。

SSR引物筛选:合成普通SSR引物300余对,对来自梨5个不同种的材料(白梨:秋白;砂梨:丰水;秋子梨:京白;新疆梨:花长把;西洋梨:哈代)进行PCR扩增,产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,筛选出多态性好、均匀分布在梨17对染色体上的SSR引物,对引物的5’端进行6’-FAM荧光修饰。荧光修饰SSR引物由上海生工有限公司合成。

PCR扩增:扩增体系为20 μL,其中DNA模板2 μL,Buffer 2 μL,dNTPs 2 μL,0.25 U Taq DNA聚合酶(英潍捷基贸易有限公司,上海),反应程序参考本实验室的方法[15]。PCR扩增产物经纯化后进行3730XL毛细管电泳(ABI,美国),以GeneScanTM500 LIZ为分子内标,获得原始基因型数据,利用GeneMapper 4.0软件获得扩增片段的数值和峰图。

1.3 数据分析利用GenAlEx 6.50软件[16]计算多态性等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、香农信息指数(I)及固定指数(F)等遗传参数,并分析群体间的群体遗传距离(GD)和遗传一致度(GI)。遗传多样性指数PIC计算公式:PIC=1-∑fij2,fij为第i个位点第j个等位基因出现的频率。

利用POPULATION 1.2[17]软件基于Neighbor-joining法构建群体聚类和个体聚类图,利用在线软件iTOL[18]对个体聚类图进行加工修饰。

利用Structure 2.3.4软件[19]分析154份梨地方品种的群体遗传结构,采用的数据模型为混合模型。设置群体数K值为2～10,每个参数运行10次,每次运行的burn-in time设置为100 000,重复次数为200 000。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选筛选的17对荧光SSR引物名称及来源见表2。

表2 南方梨地方品种在17对SSR荧光标记位点的遗传多样性特征

2.2 SSR位点多态性比较利用17对SSR荧光标记位点在154份梨地方品种中共得到303个等位基因。不同位点上检测到的等位基因数Na范围为10(NH029a)～27(NAUpy63n)个,平均值为17.8个。不同位点的有效等位基因数Ne范围为2.581(NH029a)～12.326(NAUpy08t)个,平均值为6.407个。不同位点的香农信息指数I范围为1.324(NH029a)～2.779(NAUpy08t),平均值为2.150。不同位点的观测杂合度Ho范围为0.312(NAUpy09t)～0.851(NAUpy08t),平均值为0.690。不同位点的期望杂合度He范围为0.613(NH029a)～0.919(NAUpy08t),平均值为0.822。固定指数F在NH029a和NAUpy54b中为负值,在其余15个引物中为正值,说明在154份供试材料中纯合子较多,杂合子较少。不同位点的多态性信息含量(PIC)值范围为0.578(NH029a)～0.913(NAUpy08t),平均值为0.805,说明所有位点均为高度多态性信息位点(PIC≥0.5)[20]。可见,17个SSR位点的多态性丰富,能提供可靠的遗传信息,可以检测到供试材料间丰富的遗传多样性(见表2)。

2.3 群体间的遗传距离12个群体间的遗传距离(GD)为0.181～1.576,平均值为0.537;遗传一致度(GI)为0.207～0.834,平均值为0.610。遗传距离越大,说明亲缘关系越远,遗传相似性越低。广东群体和贵州群体之间的遗传距离最大(1.576),遗传一致度最小(0.207),说明两者的亲缘关系较远。云南群体和四川群体之间的遗传距离最小(0.181),遗传一致度最大(0.834),两者的亲缘关系较近(见表3)。基于群体之间的遗传距离,构建以Neighbor-Joining法构建的聚类结果见图1。可见,群体间遗传相似性和地理分布有一定关联,地理分布越近,群体间遗传距离越小,遗传一致度越高,亲缘关系越近。

注:AH指安徽,JS指江苏,ZJ指浙江,HJ指福建,JX指江西,HB指湖北,GZ指贵州,YN指云南,SC指四川,HN指湖南,GX指广西,GD指广东,图4同。

表3 南方梨地方品种12个群体间的遗传距离(GD,对角线下方)与遗传一致度(GI,对角线上方)

2.4 群体遗传结构将Structure分析得到的LnP(D)平均值和ΔK值绘制成折线图(见图2)。发现,LnP(D)平均值折线图无明显折点。依据Evanno等[19]对最适群体数的判断理论,取ΔK最大值对应的K值为群体的最适类群数,ΔK值最大时,K=4,即154份材料可划分为4个类组(见图3)。4个类组对应的颜色分别是蓝色、绿色、红色和黄色。每个直方柱子代表一个样本,柱子的颜色及颜色比例代表这个样品属于哪个亚群及所占的亚群比例。当Q值≥0.6,认为该个体的遗传组分单一,Q值<0.6,认为该个体遗传组分复杂[24]。对Q值进行统计,发现140份材料背景单一,其中,类群1(蓝色)最多为73个,类群2(绿色)为22个,类群3(红色)为30个,类群4最少(黄色)为15个;14份材料遗传背景复杂。类群1(蓝色)品种分布广泛,除广东省外其他地区均有分布;类群2(绿色)主要集中在西南地区,云南、四川和贵州;类群3(红色)除西南和广东外均有分布;类群4(黄色)主要分布在广东,其次是广西、福建和湖南。

图2 南方梨地方品种群体遗传结构分析中K值分别与LnP(D)和ΔK值的关系

2.5 个体聚类基于个体之间的Nei’s遗传距离,以Neighbor-Joining法构建的154份梨地方品种的聚类结果见图4。在遗传距离0.54处,154份梨地方品种可划分为8个类群。类群I与其他类群遗传距离较远,亲缘关系较远,包含4个地区的6份材料,其中来自四川省2份,湖北省2份,福建省1份,江苏省1份。类群II包含7个地区的25份材料,湖北省3份,江西省6份,安徽省6份,福建省5份,江苏省3份,四川省1份,浙江省1份。类群III包含3个地区的7份材料,广西壮族自治区4份,湖北省2份,云南省1份。类群IV包含8个地区的32份材料,主要来自长江流域,浙江省11份,江西省8份,福建省4份,安徽省3份,贵州省2份,湖北省2份,湖南省1份,江苏省1份。类群V包含6个地区的29份材料,主要来自西南地区。类群VI包含5个地区的23份材料,广东省9份,广西壮族自治区6份,湖南省4份,四川省3份,福建省1份。类群VII包含5个地区的15份材料,其中四川省4份,云南省4份,湖北省3份,广西壮族自治区3份,湖南省1份。类群VIII包含17份材料,主要来自西南地区,四川省12份,贵州省4份,还有湖南省1份。个体聚类结果与地理分布有一定关联,也存在不同群体间的互相渗透。

图4 南方梨地方品种基于Nei’s遗传距离的NJ聚类

对比群体遗传结构和个体聚类分析对154份梨地方品种的划分结果可发现:类群I、III、VII和VIII基本上由红色基因库的品种组成;类群II由红色和绿色基因库的品种组成,组成比例为17∶7;类群IV主要由绿色基因库品种组成,少量为红色基因库品种;类群V由所有蓝色基因库品种和少量红色基因库品种组成;类群VI由所有黄色基因库品种和少量红色基因库品种组成;遗传背景复杂的14个品种在类群II～VII中均有分布。综上可见,个体聚类结果与其自身的遗传背景相关。

3 讨论

3.1 南方梨地方品种的多样性分析和品种鉴定SSR标记具有多态性高、共显性遗传、可重复的特性,在种质资源的遗传多样性研究、指纹图谱构建、亲缘关系分析等方面应用较多。荧光修饰的SSR与TP_M13_SSR相比[25],直接修饰的荧光SSR可以少合成一条引物,省去二次扩增的步骤,对退火温度的要求相对宽松。利用17对荧光SSR引物在154份南方梨地方品种中扩增出303个等位基因,平均每个位点的等位基因数为17.8,高于Xue等[12]的17对SSR引物通过银染法在478个梨品种中得到的等位基因数7.12。可见,与常规SSR银染法相比,荧光SSR的PCR产物经毛细管电泳后可在扩增位点上检测出更多的等位变异。本研究中,154份南方梨地方品种的遗传多样性(香农信息指数I=2.150,观测杂合度Ho=0.690,期望杂合度He=0.822)高于东亚栽培梨品种的遗传多样性(香农信息指数I=1.74,观测杂合度Ho=0.603,期望杂合度He=0.744)[13]。本研究筛选出的17对荧光SSR引物均匀分布在梨染色体上,多态性信息含量(PIC)值均大于0.5,属于高多态性位点,有助于梨种质资源的进一步挖掘利用。

在品种鉴定方面,17对荧光SSR引物可区分出142份梨品种的基因型。但“西降坞”与其芽变品种“粗皮西降坞”“细皮西降坞”没有区分开;其余4组“建阳大梨”和“政和大雪梨”,“封开惠州梨”和“北流蜜梨”,“高要青梨”、“横县蜜(绿)”和“禾花梨”,“细把清水”和“鲁沙”也没有区分开,可能为同物异名品种。

3.2 南方梨地方品种的遗传结构及聚类分析遗传结构分析可提供个体的血统来源、组成信息和不同基因型遗传信息的交流情况[26]。在梨属植物上,Wahocho等[27]开展了基于贝叶斯模型的中国西部梨种质资源和国外梨种质资源的群体结构分析,131份梨种质资源形成2个不同的亚群,即中国西部梨种质资源和国外梨种质资源。为了探明中国南方梨地方品种的遗传结构,本研究利用Structure软件分析推测154个中国南方梨地方品种的遗传结构,其中,140份(90.91%)南方梨地方品种的Q值大于0.6,说明大部分南方梨地方品种的血缘关系比较单一。其中,云南和四川的梨地方品种的基因来源以类群1(红色)和类群2(蓝色)为主,贵州的梨地方品种增加了部分类群3(绿色)的基因来源。长江流域的湖北、安徽、江苏、江西、浙江的梨地方品种的基因来源以类群1(红色)和类群3(绿色)为主,福建梨地方品种增加了部分类群4(黄色)的基因来源。广西的梨地方品种的基因来源以类群1(红色)和类群4(黄色)为主。广东的梨地方品种的基因来源为类群4(黄色),广东梨地方品种群与其他地区梨地方品种群的亲缘关系较远。一般认为梨属植物起源于中国西部或西南部山区。基于12个群体NJ聚类图来看,梨地方品种的传播以西南地区的云南、四川、贵州为起点分为两支,一支向湖北、安徽、江苏、江西、浙江和福建传播,另一支向湖南、广西和广东传播。这与Xue等[12]研究发现砂梨传播路线是沿珠江和长江流域传播至中国东南部沿海地区的结论相似。

154个南方梨地方品种的聚类结果和地理来源没有明显关联,而与其遗传背景的组成相关。产生这种结果的原因可能与梨自交不亲和特性有关,需要不同品种授粉才能产生后代,同时人类活动也促进了不同地区梨品种的基因交流。近年来随着梨育成品种的大面积推广种植,导致传统梨地方品种栽培面积逐渐减少,分析梨地方品种的遗传多样性和群体结构,对优质梨种质资源的挖掘利用、育种亲本的选配等具有重要的指导意义。