火龙果愈伤组织诱导及再生体系的建立

陈华蕊,盖江涛,何书强,冯振翠,陈业渊

(1 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海口,571101;2 中国热带农业科学院三亚研究院,海南三亚,572025)

火龙果属于仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereusundatus)多浆类植物,是热带地区独具特色的新奇特果树。火龙果果实营养丰富,具有较高的经济价值,是集水果、花卉、蔬菜、医疗保健等为一体的新型水果。生产中火龙果的种苗主要通过扦插或嫁接繁育,然而这些方法周期长、繁殖速度慢,并且在后代的遗传中极易发生变异。开展火龙果的愈伤组织诱导及其再生体系的建立,既能有效提高种苗良种繁育系数,也为火龙果的遗传转化研究提供支撑。彭思维等[1]研究认为,紫红龙品种的幼嫩茎段通过添加TDZ、2,4-D 和NAA的组合配比能成功诱导出愈伤组织,诱导率高达89.1%。邢玉良等[2]以幼嫩茎段为试材,研究发现,最适诱导愈伤组织的培养基是MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L,诱导率达92.7%。也有研究表明,以茎段和子叶作为外植体均能诱导出愈伤组织[3]。本研究在前人研究的基础上探索利用红皮红肉品种“金都一号”不同成熟期茎段为外植体,通过对影响火龙果再生的诸多因素开展研究,筛选和优化火龙果植株再生适宜的培养基配方,获得高效的火龙果愈伤组织诱导及分化方法,建立稳定的火龙果再生体系,为火龙果规模生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料火龙果品种:金都一号,取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所火龙果种质圃。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体处理 选取成年火龙果植株上无病害的幼嫩茎段、成熟茎在自来水下将表面的灰尘冲洗20 min,用毛刷经过洗洁精刷洗干净后,去除茎段上的黏液,然后用手术刀将冲洗后的茎段沿髓部将3棱分开,切成2 cm左右的片段。幼嫩茎段经过75%酒精30 s+次氯酸钠5 min+0.1 %升汞10 min处理,再用无菌水冲洗5次;成熟茎段采用75%酒精30 s+次氯酸钠10 min+0.1%升汞15 min消毒,无菌水冲洗5次,备用。

将消毒灭菌的幼嫩茎段接入不定芽的诱导培养基上,待不定芽长到4～6 cm长时,将不定芽切下并切成2 cm左右的茎段,备用。培养条件(25±2)℃,光强2 000～2 500 lx,光照时间12 h/d。

1.2.2 不同成熟度茎段对愈伤组织的诱导影响 将以上处理好的幼嫩茎段、成熟茎段、幼苗茎段横接在MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培养基上,每个类型外植体接种10瓶,每瓶3个外植体,重复3次。观察记录不同外植体类型愈伤组织形态及诱导率。

将幼苗茎段切成1～2 cm以水平接和垂直接的方式接种于MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基中,观察比较2种接种方式对愈伤组织诱导的影响

1.2.3 不同基本培养基类型对愈伤组织诱导的影响 取备用的幼嫩茎段接入不同的培养基中:MS、1/2MS、1/4MS、B5,分别添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,每个类型的培养基中接15瓶,每瓶2个外植体,重复3次。观察并统计愈伤组织生长形态及诱导率。

1.2.4 不同生长调节剂浓度及外植体类型对愈伤组织诱导的影响 将消毒灭菌后的成熟茎段、幼嫩茎段、幼苗茎段接种于以蔗糖(30 g/L)+卡拉胶(8 g/L)的MS为基本培养基,分别附加生长调节剂TDZ(0.2、0.6、1.0 mg/L)、KT(0.6、0.8、1.0 mg/L)、2,4-D( 0.5、1.0、2.0 mg/L)、6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)的培养基上培养,每个处理接种10瓶,每瓶2个外植体,重复3次。接种后定期观察愈伤组织的生长状况,50 d后计算诱导率。

1.2.5 愈伤组织诱导不定芽生长调节剂的筛选 将初代培养诱导出来的黄绿色致密的愈伤组织切割成约0.5 cm×0.5 cm大小,接种到不定芽诱导培养基中。培养基用MS基本培养基,附加6-BA、NAA生长调节剂组合设计。每处理接种10个外植体,重复5次,接种后40 d对不定芽数进行统计,初步筛选获得最佳生长调节剂种类和浓度配比。

1.2.6 生根培养 当芽苗长至2～4 cm时,切下单个芽转入生根培养基上进行生根培养,以MS培养基为基本培养基,分别附加NAA 0.1～0.5 mg/L、 6-BA 0.5～1.5 mg/L,每种培养基接种10瓶,每瓶接种3株,重复3次。接种20 d后调查诱导生根情况。50 d后统计生根率(生根芽苗数/接种芽苗数×100%)及平均生根数,并观察生根苗长势。待不定根平均3～4条时于室温中炼苗7 d后移栽至营养土中。

1.2.7 数据处理分析 愈伤组织诱导率(%)=出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100;愈伤组织分化率(%)=分化出芽的愈伤组织外植体数/接种的外植体数×100。采用SPSS 18.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度茎段对愈伤组织诱导的影响

不同外植体接种10 d左右,切口慢慢膨大,随后切口处逐渐产生黄白色或黄绿色的愈伤组织。从表1可知,“金都一号”火龙果的不同成熟度茎段均能诱导出愈伤组织,幼苗茎段诱导率为81.5%,显著高于成熟茎段和幼嫩茎段,而成熟茎段的诱导率最低为38.9%。成熟茎段诱导的愈伤组织呈黄白色疏松状,在后期培养过程中疏松状愈伤组织会逐渐变褐色,甚至死亡。利用幼嫩茎段或幼苗茎段诱导愈伤组织,诱导率高,愈伤组织呈黄绿色坚硬致密状,在后期培养中容易增殖并分化成苗。

表1 不同成熟度茎段对火龙果愈伤组织诱导的影响

2.2 不同接种方式对愈伤组织诱导的影响

茎段的接种方式主要有水平接和垂直接(见图1)。水平接的茎段能较大面积地接触培养基,茎段上的刺座及两个切面均能诱导出愈伤组织,而垂直接只有茎段的单个切面接触培养基,而愈伤组织一般在刺座和切口周围萌发,因此,水平接诱导的愈伤组织明显多于垂直接,有利于愈伤组织的诱导。

注:A 水平接;B 垂直接。

2.3 不同基本培养基类型对愈伤组织诱导的影响

如表2所示,在MS、1/2MS、1/4MS、B5等4种不同的基本培养基中添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,愈伤组织的诱导率差异达显著水平,其中以MS培养基的诱导率最高,达到76.7%,愈伤组织呈黄绿色致密状,体积较大,诱导率最低的是B5培养基,未见愈伤组织产生。因此,本实验采用MS为基本的培养基。

表2 不同基本培养基对火龙果愈伤组织诱导的影响

2.4 TDZ对愈伤组织诱导的效果

TDZ具有极强的细胞分裂活性,对诱导植物愈伤组织的效果显著[1,4]。为筛选合适的浓度,研究了添加不同浓度TDZ对火龙果幼嫩茎段愈伤组织诱导的效果。由表3可看出,愈伤组织诱导率随TDZ浓度增加而增加,TDZ浓度为0.1 mg/L时,愈伤组织诱导率为16.7%;TDZ浓度为0.6 mg/L时,诱导率达到56.7%,显著高于其他浓度水平(p<0. 05);TDZ浓度升高为1.0～1.5 mg/L时,诱导率为50%～55%,略有下降,但是变化不大。TDZ浓度在0.6～1.0 mg/L之间有利于愈伤组织的诱导。

表3 不同浓度TDZ对火龙果幼嫩茎段愈伤组织诱导的影响

2.5 不同生长调节剂浓度及外植体类型对愈伤组织诱导的效果

成熟茎段在添加TDZ、KT和2,4-D的组合中均能诱导出愈伤组织,但并未见不定芽发生。愈伤组织形态特征主要表现为乳白色疏松、黄白色疏松,黄绿色致密、白色带红色疏松(见图2)。当TDZ的浓度相同时,愈伤组织诱导率随着KT和2,4-D浓度的增加而增加,而当2,4-D的浓度一定时,愈伤组织诱导率随着TDZ和KT浓度的增加而增加。当TDZ 1.0 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L时愈伤组织诱导率最高,达到58.3%(见表4),诱导的愈伤组织大部分呈黄白疏松状,只有少量的致密黄绿色愈伤组织产生。在后期的培养中,呈疏松状的白色或黄白色带红色愈伤组织容易褐化死亡,很难分化成不定芽(见图3)。

注:A 乳白色疏松愈伤组织;B 黄白色疏松愈伤组织;C 绿色致密愈伤组织;D 白色带红色疏松愈伤组织。

图3 愈伤组织褐化和愈伤组织诱导不定芽

由表5可以看出,将幼嫩茎段接种于培养基20 d 后,茎段切口开始膨大诱导形成愈伤组织,同时刺座部位膨大隆起并冒出不定芽。愈伤组织形态呈绿色致密、黄绿色致密以及黄白色疏松状。TDZ添加KT和2,4-D的效果明显优于TDZ单独使用。随着TDZ浓度的增加,愈伤组织诱导率逐渐升高,高浓度TDZ有利于愈伤组织诱导,0.2、0.6 mg/L TDZ添加KT、2,4-D后诱导的愈伤组织呈绿色或黄绿致密状,愈伤组织的诱导率也随着KT浓度的增加而增加,最高达到81.7%,显著高于其他组合,不定芽再生率也随着KT、2,4-D浓度的增加而增加,最高达到36.3%。当TDZ浓度为1.0 mg/L时,愈伤组织质地疏松,呈黄白色,诱导率随着KT浓度增加而增加,不定芽诱导率随着KT浓度增加而降低,KT增加到1.0 mg/L时,不定芽再生率为19.8%。由此可见,TDZ在一定范围内能成功诱导出愈伤组织,但过高的浓度会致使愈伤组织质地疏松,不利于后期愈伤组织的分化。因此,较适宜幼嫩茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+TDZ 0.6 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L。

表5 不同的生长调节剂浓度配比对火龙果幼嫩茎段愈伤组织诱导的影响

幼苗的茎段接种于含有不同生长调节剂配比的培养基上诱导愈伤组织,结果如表6所示。6-BA浓度在1.0～3.0 mg/L时配合2,4-D使用均能诱导出愈伤组织。愈伤组织的表现形态有差异,有白色疏松状、黄绿色致密,绿色带白疏松状(见图4)。经方差分析结果表明,不同浓度的6-BA和2,4-D配比对愈伤组织的诱导有显著效果。当6-BA的浓度不变时,愈伤组织的诱导率随着2,4-D浓度的增加而增加,最高可达到93.3%。6-BA增加至3.0 mg/L时,诱导的愈伤组织中间绿色边缘泛白,疏松状,后期培养的过程中容易增殖但不容易分化。当6-BA浓度为2.0 mg/L,2,4-D浓度为1.0 mg/L时愈伤组织的诱导率最高,达到91.7%。明显高于幼嫩和成熟茎段的诱导率。

注:A 白色疏松状;B:黄绿色致密;C:绿色带白,疏松状。

表6 不同生长调节剂浓度配比对火龙果幼苗茎段愈伤组织诱导的影响

2.6 愈伤组织诱导不定芽

接种10 d之后,呈致密状黄绿色的愈伤组织逐渐膨大;培养40 d后,愈伤组织上有绿色的芽点产生(见图4)。如表7所示,6-BA浓度在 1.0～4.0 mg/L 时配合NAA浓度 0.1～0.5 mg/L均能诱导不定芽的产生。不同浓度的6-BA、 NAA对愈伤组织诱导不定芽都有显著影响,当较低浓度的6-BA(1.0 mg/L)与适当浓度的NAA组合时,不定芽的诱导率较低,诱导率5%～17%;当较高浓度的 6-BA(2.0～4.0 mg/L)与适当浓度的NAA组合时,愈伤组织不定芽的诱导率较高,可高达88%。在合适的范围内,当 6-BA浓度相同时,不定芽诱导率基本随着NAA浓度的提高而增加,但当NAA升高到0.5 mg/L时,愈伤组织诱导不定芽的诱导率有所下降,但是变化不大。综上所述,不同浓度6-BA和NAA组合对愈伤组织不定芽诱导的影响不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培养基的不定芽诱导效果最好,达到了88%。

表7 不同浓度6-BA与NAA组合的培养基对火龙果不定芽诱导的影响

2.7 生根培养

再生不定芽接种30 d后开始有根系的生成,60 d后即可炼苗移栽。由表8可知,不同处理组合间再生芽的生根率存在极显著差异,且诱导形成的不定根长势不一致。随着 6-BA浓度的升高,茎段生根率极显著提高,从23.3%上升到97.8%,且平均根数从2.3根增加到7.2根。6-BA的浓度增加到1.5 mg/L时,生根率显著下降,降到62.2%。因此,在MS培养基中添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L,芽和根长势较强壮,平均根长为8.8 cm,平均根数为7.2条,生根率为 97.8%。研究发现,在添加6-BA和NAA的生根培养基上同时会诱导出腋芽,当6-BA的浓度大于0.5 mg/L时,诱导的腋芽明显增多且长势健壮,这与彭思维等的研究结果一致[1]。苗在室温中炼苗5～7 d,移栽到营养盆中,成活率达到100%。

表8 不同生长调节剂配比对火龙果生根的影响

3 结论与讨论

本研究发现,火龙果不同的外植体类型诱导的愈伤组织主要有以下几种形态类型:白色疏松状、黄白色疏松状、黄绿色疏松状、白色带红色疏松状、黄绿色致密颗粒状,这与彭思维等的研究结果一致[5]。其中,白色疏松状、黄白色疏松状、白色带红色疏松状愈伤组织在培养过程中容易褐化死亡,而黄绿色致密颗粒状的愈伤组织在后期的培养中能够增殖并诱导不定芽的发生。在试验中发现,为了抑制疏松状愈伤组织褐化死亡,主要采用短时间内多次转瓶或暗培养等措施来减少褐化率,但未得到良好的效果,愈伤组织最后还是会褐化死亡。Asmus B、彭思维等[1,6]认为,愈伤组织呈疏松状是由于代谢活动过强引起的,而褐化现象可能是醌类物质扩散到培养基中而使其颜色变化引起的酶促变褐色。

关于火龙果愈伤组织再生方面的研究已有报道,主要是成熟茎段、幼嫩茎段、幼苗茎段、子叶或花粉作为外植体[2,7-10]。火龙果同一品种不同类型外植体诱导愈伤组织的效果也不同。有研究学者认为,幼嫩茎段更容易诱导愈伤组织,诱导率达到89.1%[1]。本研究以不同成熟度的茎段为外植体作为研究对象,结果表明,幼芽诱导率(91.7%)明显大于幼嫩茎段(81.7%)和成熟茎段(58.3%)。由此说明,愈伤组织的诱导率与外植体的类型有关,也与外植体本身的生理特性有关。采用幼芽茎段作为外植体,其生长状态属于幼嫩阶段,再生能力较强。黄红梅等[3]的研究也表明,幼芽诱导愈伤组织的诱导率更高,与本试验的结果一致。

本试验研究了不同质量浓度TDZ 、KT、2,4-D、6-BA的混合配比对愈伤组织的诱导效果,结果发现,不同外植体对生长调节剂的敏感度不一样,老熟茎段诱导的愈伤组织以疏松状为主,在后期增殖分化培养基中容易褐化死亡,而以幼嫩茎段或幼苗茎段诱导的愈伤组织大部分呈黄绿色致密状或绿色致密状,在后期培养中容易分化成不定芽。因此,应选择幼嫩或幼苗茎段作为外植体。研究还发现,添加不同浓度TDZ对愈伤组织的诱导有显著差异,在幼嫩茎段诱导愈伤组织过程中,愈伤组织的诱导率随着TDZ浓度的增加而增加,当TDZ浓度大于1.0 mg/L时诱导率逐渐降低,诱导的愈伤组织质地变疏松,不利于后期的增殖和分化。

不同植物生长调节剂种类及配比是组织再生的关键。本实验结果表明,不同浓度6-BA、NAA组合对火龙果愈伤组织分化不定芽均存在极显著影响。一定浓度6-BA与低浓度NAA配合使用,愈伤组织分化的效果较好,但当NAA浓度提高到0.5 mg/L时,芽的分化率会降低。不同浓度6-BA和NAA组合对愈伤组织不定芽诱导的影响不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培养基的不定芽诱导效果最好。