土拉弗朗西斯菌FopA单抗阻断ELISA抗体检测方法的建立

崔国林,戚心怡,吴 村,蔡梦雷,张政钢,赵东旭,翟新国

土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)是一种严格胞内寄生的革兰阴性短杆菌,引起人类和多种动物自然疫源性疾病——土拉热[1]。该菌分4个亚种,其中土拉亚种(subsp.tularensis)对人类和动物的致病力极强,如未及时治疗可导致60%以上的死亡率,主要分布于北美地区;全北极亚种(subsp.holarctica)和新杀手亚种(subsp.novicida)致病力相对较弱,一般不引起人类和动物死亡,主要分布于包括我国在内的北半球[2]。土拉热在我国的自然疫源地众多,主要包括内蒙古、西藏、新疆、吉林及黑龙江等地区。流行病学调查显示,土拉弗朗西斯菌在我国北方地区的鼠类、蜱虫甚至牛羊等动物群体中均有不同感染水平[3-6],非常有利于该菌在动物与养殖人员甚至接触人员间传播。但由于我国流行的土拉弗朗西斯菌亚种一般不引起特征性临床症状,加之偏远地区医疗资源和诊断技术缺乏,不易确诊土拉热,因此亟需建立一种人类和动物群体中的土拉弗朗西斯菌诊断和流行病学调查方法。

FopA蛋白C末端具有保守的OmpA结构域[7],与大肠杆菌OmpA蛋白具有较高同源性(氨基酸同源性约为60%),在土拉弗朗西斯菌各亚种间高度保守(氨基酸同源性>98.5%),常被作为土拉弗朗西斯菌鉴定靶位[8]。另一方面,FopA蛋白具有良好的免疫原性,可诱导机体产生高水平抗体[7,9-10],因此血清中FopA抗体具有作为土拉弗朗西斯菌感染检测指标的应用潜力。鉴于此,本研究克隆fopA基因并进行原核表达,以此蛋白免疫小鼠制备单抗,并基于该单抗建立一种直接阻断ELISA抗体检测方法,以实现人类和动物感染土拉弗朗西斯菌的快速检测。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华公司。

1.2 菌株、细胞及质粒 土拉弗朗西斯菌新杀手亚种U112、土拉弗朗西斯菌全北极亚种LVS由清华大学张敬仁教授惠赠;SP2/0骨髓瘤细胞由北京市兽医实验诊断所惠赠;感受态细胞均购自北京天根公司;pET-32a质粒由本实验室保存。

1.3 主要化学试剂及血清 抗生素、弗氏佐剂均购自Sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清均购自Gibco公司;TSB培养基、TSA培养基、脱脂奶粉均购自BD公司;镍-琼脂糖凝胶、BCA蛋白浓度测定试剂盒、TMB显色液购自索莱宝公司;SBA Clonotyping System-HRP试剂盒购自北京博奥龙公司;Protein A+G Agarose购自碧云天公司;大肠杆菌、沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌阳性血清由实验室保存。

1.4 土拉弗朗西斯菌FopA原核表达 参考文献[1]方法制备FopA原核表达蛋白。以GenBank发布的土拉弗朗西斯菌U112的基因组序列(NC_008601)为模板设计fopA基因克隆引物(见表1),将其扩增的fopA基因序列与pET-32a质粒连接后转化BL21(DE3)菌株,利用镍-琼脂糖凝胶纯化蛋白,并采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的FopA蛋白浓度。利用相似方法制备FopA截短片段原核表达蛋白(表1),分别命名为F1、F2、F3。

表1 本研究使用的引物

1.5 FopA单抗细胞株制备 参考文献方法制备FopA单抗细胞株[11]。选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠,采用颈背部皮下途径首免150 μg FopA蛋白,间隔2周采用相同免疫途径进行二免和三免,FopA蛋白免疫剂量为100 μg,三免后2周采用腹腔注射途径接种100 μg FopA蛋白,之后3 d将小鼠断颈处死,取小鼠脾脏与SP2/0细胞进行融合,并筛选FopA阳性单抗细胞株。收集单抗细胞株培养上清,采用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒鉴定单抗亚类。

1.6 小鼠腹水FopA单抗的制备 选择10周龄雌性BALB/c小鼠,提前7 d腹腔注射灭菌液体石蜡0.5 mL/只,采用新鲜制备对数生长期单抗细胞株,腹腔注射致敏小鼠,5×105细胞/只,注射后10 d,解剖腹部明显隆起小鼠并收集腹水,利用Protein A+G Agarose亲和纯化单抗,纯化的FopA单抗分装后保存于-80 ℃冰箱。

1.7 阻断ELISA方法的建立 采用改良过碘酸钠氧化法标记HRP于纯化的FopA单抗。按照如下方法进行阻断ELISA:选择空白ELISA板,加入0.05 mol/L碳酸钠(pH为9.6)稀释的LVS超声裂解液,4 ℃包被16～24 h;弃去包被液,PBST洗涤3次,加入5%脱脂奶,37 ℃封闭1 h;弃去脱脂奶,PBST洗涤3次,加入待检血清,37 ℃孵育1 h;弃去待检血清,PBST洗涤3次,加入HRP标记FopA单抗,37 ℃孵育1 h;弃去酶标单抗,PBST洗涤3次,加入TMB显色液,37 ℃静置15 min;加入2 mol/L H2SO4,利用酶标仪检测OD450。

1.8 特异性试验 选择实验室保存的大肠杆菌、沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌阳性血清进行阻断ELISA,评估该方法特异性。

1.9 敏感性试验 选取小鼠阳性和阴性血清各3份,分别倍比稀释1∶10～1∶20 480后进行阻断ELISA,评估该方法敏感性。

1.10 重复性试验 批内重复:选取小鼠阳性和阴性血清各3份,使用同一批次包被酶标板进行阻断ELISA,每份样品重复8次。批间重复:选取小鼠阳性和阴性血清各3份,使用8个批次包被的酶标板进行阻断ELISA,每份样品重复8次。

1.11 符合率检验 参考文献方法制备LVS平板凝集抗原[12]。选取小鼠阳性血清76份和阴性血清124份,分别采用阻断ELISA和平板凝集试验进行检测,比较两种方法的符合率。

1.12 小鼠血清抗体变化趋势检测 选取对数生长期的LVS,采用3 000 CFU滴鼻感染10只BALB/c小鼠,并选取5只小鼠作为阴性对照,间隔3 d进行眼球静脉采血,收集血清进行阻断ELISA。

2 结 果

2.1 FopA原核表达蛋白检测 利用PCR扩增去除信号肽片段的fopA基因全长(图1A),将其连接pET-32a原核表达质粒,并转化BL21(DE3)表达菌株,通过1 mmol/L IPTG诱导,蛋白以包涵体形式表达,利用镍-琼脂糖凝胶纯化获得FopA融合表达蛋白(图1B),蛋白浓度为4.28 mg/mL。

图1 fopA基因扩增(A)与FopA蛋白原核表达纯化(B)检测

2.2 FopA单抗制备与检测 利用FopA原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠制备FopA单抗,筛选获得2株FopA单抗细胞株,分别命名为C1-2和C2,C1-2分泌的抗体重链为IgG1亚类、轻链为κ型,C2分泌的抗体重链为IgM类、轻链为κ型(表2)。采用Protein A+G Agarose亲和纯化C1-2小鼠腹水(图2A),获得的FopA单抗浓度为3.45 mg/mL。Western blotting检测发现,FopA单抗与LVS裂解液反应仅出现单一条带,且条带分子量大小与FopA蛋白分子量相符,与FopA原核表达菌株裂解液反应亦仅出现单一条带,且条带分子量大小与FopA融合蛋白分子量相符(图2B)。

注:M.DNA分子量标准;C1-2.纯化的FopA单克隆抗体;LVS.LVS的超声裂解液;Pet-FopA.表达FopA蛋白的BL21(DE3)的超声裂解液;F1-F3.表达FopA蛋白截断片段F1-F3的BL21(DE3)的超声裂解液。

表2 单抗亚类和型鉴定(OD450)

为进一步检测FopA单抗靶向FopA蛋白的抗原表位,分节段表达FopA蛋白片段,如图2C所示,FopA单抗与F2和F3节段均产生特异性条带,结合F2和F3重叠片段,提示FopA单抗靶向FopA蛋白的抗原表位为:ATTAAQTVAMPTIDESKY-VLPAGIKQCEGNFNLTEDGV(aa 227-264)。

2.3 阻断ELISA方法建立 利用棋盘法筛选包被抗原和FopA单抗最优稀释度,按照OD450值接近1.0,且P/N值较高的筛选标准,FopA单抗最优稀释度为1∶4 000、抗原最佳包被浓度为3 μg/mL(表3)。1∶10稀释时,阳性血清的阻抑率均高于70%,且其与阴性血清的阻抑率相差最大,因此选择待检血清的最优稀释度为1∶10(图3)。

图3 待检血清最优稀释度筛选

表3 包被抗原与FopA单抗最优稀释度筛选

选择阴性小鼠血清进行阻断ELISA,所有阴性血清阻抑率分布符合正态分布(图4),阻断ELSIA阻抑率阳性临界值为41%,阴性临界值为27%,可疑范围为27%～41%。

图4 阴性血清阻断ELISA检测结果

2.4 特异性检测 选择多种细菌阳性血清进行阻断ELISA检测,仅土拉弗朗西斯菌阳性血清阻抑率高于阳性临界值,其它细菌阳性血清阻抑率均低于阴性临界值(图5),提示建立的土拉弗朗西斯菌抗体检测阻断ELISA方法特异性良好。

注:上、下两条虚线分别代表阳性、阴性临界值。

2.5 敏感性检测 采用建立的阻断ELISA方法检测梯度稀释的阴性和阳性血清,1∶640稀释后,所有阳性血清的阻抑率仍高于41%(图6),呈阳性结果,提示建立的阻断ELISA方法敏感性良好。

注:上、下两条虚线分别代表阳性、阴性临界值。

2.6 重复性检测 选取阴性和阳性血清分别进行批内和批间重复检测,批内重复检测变异系数最高为7.59%,批间重复检测变异系数最高为9.16%,均低于10%(表4),提示阻断ELISA方法重复性良好。

表4 阻断ELISA批内和批间重复检测

2.7 符合率检测 选取76份土拉弗朗西斯菌阳性鼠血清和124份阴性鼠血清,分别采用阻断ELISA和平板凝集试验进行检测,两种方法检测阳性血清均呈阳性,阴性血清均呈阴性,符合率100%。

2.8 土拉弗朗西斯菌攻毒小鼠血清抗体检测 采集土拉弗朗西斯菌攻毒后不同日龄的小鼠血清,利用建立的阻断ELISA方法检测,攻毒9 d后,血清抗体呈阳性,并随感染日龄逐步升高(图7)。

注:上、下两条虚线分别代表阳性、阴性临界值。

3 讨 论

土拉弗朗西斯菌是一种人兽共患病原菌,对培养条件要求较高,导致实验室分离困难,加之该菌可感染人类,细菌分离具有一定的危险性,因此血清学方法是一种适于该菌临床感染检测和流行病学调查的常规方法[13]。凝集试验是最早用于土拉弗朗西斯菌感染检测的血清学方法,常被作为血清学检测金标准[13],并用于评测其它血清学方法。

FopA是土拉弗朗西斯菌主要外膜蛋白,在各亚种间结构高度保守、免疫原性高[14],常被用作土拉弗朗西斯菌亚单位疫苗开发靶位[9]。本研究利用原核表达系统获得去除信号肽的FopA蛋白,并以此蛋白免疫BALB/c小鼠制备单抗,以尽可能获得靶向FopA外膜区域的单抗。经过筛选,获得2株单抗细胞株,分别分泌IgG和IgM类抗体,但由于IgM类抗体表达量低且不易纯化,故本研究仅选用IgG类单抗进行方法建立。通过FopA蛋白分节段表达证实C1-2单抗靶向FopA蛋白227-264位氨基酸,该序列位于FopA蛋白的Linker区和CTD区连接处[14],与其它细菌OmpA家族蛋白无同源性,不易出现交叉反应。

采用土拉弗朗西斯菌感染后不同日龄的小鼠血清模拟临床感染阶段,但由于感染菌量过高,部分攻毒小鼠死亡,故仅展示一组数据的阻抑率数据。LVS感染后9 d,建立的阻断ELISA即可检出阳性抗体,与土拉弗朗西斯菌抗体产生时相基本相符[13],说明本研究建立的阻断ELISA方法敏感性和特异性较高,适于实验室血清抗体检测。

研究者发现,虽然许多土拉弗朗西斯菌的ELISA检测方法在实验室检测结果良好,但在临床检测中会出现敏感性和特异性降低的问题[13],可能与临床样本中抗体成分复杂有关,因此需要在临床条件下评估建立的ELISA方法。由于本研究中使用的小鼠血清来源于人工感染小鼠,对建立的阻断ELISA评估具有一定的局限性,后续将收集我国中西部地区动物血清,评估该方法的适用性,并调查我国土拉弗朗西斯菌感染现状。

本研究利用原核表达系统成功表达FopA蛋白,筛选获得1株FopA IgG单抗细胞株,并基于该单抗建立一种敏感性、特异性、重复性良好的阻断ELISA方法,该方法适于检测模拟临床样本,为我国土拉弗朗西斯菌流调和防控奠定技术基础。

利益冲突：无

引用本文格式：崔国林,戚心怡,吴村,等.土拉弗朗西斯菌FopA单抗阻断ELISA抗体检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报,2023,39(9):850-856.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.