基于mt-roGFP1荧光探针研究几种植物源除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

桑杰,吕鹏飞,朱雪珍,周利娟

(华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广东 广州,510462)

利用氧化还原敏感绿色荧光蛋白(reduction-oxidation sensitive green fluorescence protein,roGFP)检测活体氧化还原电位的方法,是将一个本身不含二硫键且对生物系统没有影响的蛋白特异性表达并定位到特定的亚细胞结构中,可以无损伤检测活细胞内的氧化还原电位。Hanson 等[1]将野生型绿色荧光蛋白(GFP)进行改造后得到对氧化还原敏感的探针(roGFP),试验证实该探针可以响应哺乳细胞内氧化还原状态的改变,能够对细胞内氧化还原状态的改变进行实时无损害监测。Jiang 等[2]将roGFP基因引入模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中,通过荧光强度比率能够迅速反映所处环境的氧化还原状态这一特点,证实roGFP探针能够响应拟南芥细胞中氧化还原状态的变化。由于roGFP探针的荧光强度仅受细胞中氧化还原状态改变的影响,从而消除了由探针浓度、光漂白以及组织厚度等引起的误差,因此为研究植物活体细胞中氧化还原状态奠定了基础。

roGFP是一种GFP的突变体,位于荧光发射团附近的S147和Q204氨基酸残基在遇到氧化还原状态发生改变时会突变成半胱氨酸,形成半胱氨酸对[1]。细胞氧化还原状态变化会引起roGFP构象发生变化,从而改变其生色团的荧光特性。因此可以利用荧光比率来反映荧光的变化,即在氧化状态时,410 nm/470 nm的比值较高,而在还原状态时,其比值较低[2]。另外,在植物中,roGFP是氧化还原敏感的,并且能实时动态的检测植物体内的氧化还原电位[3]。与荧光染料相比[4-5],roGFP荧光探针因具备非破坏性、局域测定、可逆、实时和动态的优势,成为评估细胞内氧化还原平均状态的一种方法,适用于许多生物和细胞类型[6-8]。

李佳霖等[8]和周毅峰等[9]先后报道从秃杉中分离出的秃杉素、台湾脂素E和台湾脂素H具有一定的除草活性,秃杉素对三叶鬼针草、薇甘菊和胜红蓟马等杂草根长IC50值(7 d)为0.18～0.83 μg·mL-1,鲜重IC50值为0.80～1.14 μg·mL-1,50 μg·mL-1台湾脂素H(7 d)完全抑制对反枝苋、胜红蓟和薇甘菊等杂草根生长,50 μg·mL-1台湾脂素E(7 d)能完全抑制胜红蓟等杂草根生长。本论文研究植物源除草化合物对mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根尖细胞氧化还原电位的影响,分析它们对植物细胞氧化还原电位影响的变化规律,研究其对植物细胞作用的方式,对利用roGFP1荧光探针技术研究新型植物源除草化合物作用机制提供基础,也为建立除草活性化合物快速筛选平台提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株由加州大学伯克利分校Lewis J. Feldman教授提供,该材料为氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(roGFP1荧光探针)基因靶向表达到线粒体中的拟南芥转基因植株(mitochondria-roGFP1,mt-roGFP1)。

秃杉素(TSC-3)、台湾脂素H(Taiwanin H)、台湾脂素E(Taiwanin E)(图1)和氟乐灵均由本实验室提供;过氧化氢(H2O2)水溶液购于天津市大茂化学试剂厂;二硫苏糖醇(DTT)水溶液购于生工生物工程(上海)股份有限公司;有机相微孔滤膜(0.22和0.45 μm)购于上海兴亚净化材料厂;荧光显微镜购于ZEISS公司。

图1 供试化合物结构式Fig.1 Structures of the test compounds

1/2 MS培养基:NH4NO31 650 mg·L-1、KNO31 900 mg·L-1、CaCl2·2H2O 440 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370 mg·L-1、KH2PO4170 mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.80 mg·L-1、Na2-EDTA 7.30 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO36.20 mg·L-1、MnSO4·4H2O 16.90 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L-1、肌醇 100 mg·L-1、甘氨酸2 mg·L-1、琼脂 10 000 mg·L-1、蔗糖 5 000 mg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的种植配制1/2 MS培养基,用1 mg·L-1NaOH溶液调其pH值至5.7～5.8,最后加入10 g·L-1的琼脂粉,放入121 ℃高温灭菌锅中灭菌20 min,高温灭菌后将其放置干净无菌环境,随后在超净工作台将mt-roGFP1标记的拟南芥转基因种子放入灭过菌的2 mL离心管中,用100%(体积分数)异丙醇清洗消毒5 min,然后用15%次氯酸钠溶液充分浸泡10 min,再用无菌水清洗3～4次,直至洗出液无色,在4 ℃冰箱放置2～3 d。

将待用仪器及培养皿和培养基等用具放入超净工作台紫外灭菌30 min。30 min后用5 mL移液枪吸取20 mL加热溶化后的1/2 MS培养基到10 cm×10 cm方形培养皿中,待其完全冷却凝固,将用无菌水清洗3～4次春化后的mt-roGFP1标记的拟南芥转基因种子,用移液枪均匀播种到凝固培养基上,待水分完全蒸发后,用封口膜将培养皿密封封口。将培养皿竖直放置在光照度4 000 lx、(22±1)℃、16 h/8 h(光照时间/黑暗时间)光照培养箱培养7 d。

1.2.2 氧化还原电位测定取1片干净的载玻片于操作台上,在载玻片中间滴1滴10%甘油,用小刷子刷开,使其均匀分布,挑选1株生长7 d的mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株置于载玻片上,制成玻片,然后利用显微镜分别在410和470 nm处观察mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根部,并拍照(曝光值为2 000 ms),以30 mm小圆范围测量荧光强度(图2),保存数据,其中410 nm/470 nm荧光强度比值为未处理值(设为x);在24孔板中取10孔,每孔加入1 mL无菌水,再加入0.1 μg·mL-1秃杉素溶液以及1、5和10 μg·mL-1秃杉素溶液、台湾脂素H和台湾脂素E,混合均匀,将上述测完的mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株完全浸泡在配制好的溶液中处理15 min,重新测定其410和470 nm处荧光强度,即为处理组;将上述同一mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株用100 mg·L-1H2O2处理15 min,测定410和470 nm荧光强度,其比值为最大氧化还原电位时的比值(设定为A);再将上述同一组mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株用100 mg·L-1DTT处理15 min,测定410和470 nm 荧光强度,其比值即为最小氧化还原电位时的比值(设定为B);按照公式(1)和公式(2)计算其氧化还原电位[10]

图2 mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株(7d)根尖分区图Fig.2 Different zoning area of the mt-roGFP1 labeled Arabidopsis thaliana plants(7 d)小圆直径30 μm Small circle diameter is 30 μm;RC:根冠Root cap;PM:分生区Proximal meristem;TZ:过渡区Transition zone;EZ:伸长区Elongation zone.

y=(x-B)/(A-B)

(1)

f=y0+a/(1+exp(-y-x0)/b)

(2)

式(2)中:y0=0.01;a=0.99;x0=-288;b=13。重复上述步骤,10株mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株为1组重复,共3组;试验重复3次,并拍照记录相关信息。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2016软件处理数据,相关数据用SPSS 20.0软件进行统计,采用邓肯氏新复极差多重比较法(Duncan’s Multiple Ranger Test,DMRT)进行方差分析,采用Office 2016及Origin Pro 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度秃杉素对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

从图3可知:秃杉素处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后显著降低其分生区线粒体氧化还原电位,且电位变化差值与化合物秃杉素的浓度大小有关。0.1、1、5和10 μg·mL-1秃杉素分别处理拟南芥15 min后,其分生区线粒体氧化还原电位变化最大差值的均值分别为13.06、18.59、27.74和29.92 mV;最小差值的均值分别为4.54、4.87、9.47和7.87 mV。

0.1、1、5和10 μg·mL-1秃杉素分别处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后,根冠线粒体氧化还原电位变化差异不显著,但是分生区、伸长区、成熟区线粒体氧化还原电位变化差异均出现显著性差异。

2.2 不同浓度台湾脂素H对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

从图4可知:台湾脂素H处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后显著降低其分生区线粒体氧化还原电位,且电位变化差值与台湾脂素H的浓度大小有关。1、5和10 μg·mL-1台湾脂素H分别处理拟南芥15 min后,其分生区线粒体氧化还原电位变化最大差值的均值分别为12.21、15.72和22.67 mV;最小差值的均值分别为5.59、10.66和17.85 mV。1、5和10 μg·mL-1台湾脂素H分别处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后,根冠、分生区、伸长区、成熟区线粒体氧化还原电位变化量均出现显著性差异。

图4 不同浓度台湾脂素H对拟南芥根细胞氧化还原电位的影响Fig.4 Effects of different concentrations of Taiwanin H on the redox potential of root cells of A.thaliana

2.3 不同浓度台湾脂素E对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

从图5可知:台湾脂素E处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后显著降低其分生区线粒体氧化还原电位,且电位变化差值与台湾脂素E的浓度大小有关。1、5和10 μg·mL-1台湾脂素E分别处理拟南芥15 min后,其分生区线粒体氧化还原电位变化最大差值的均值分别为14.71、24.03和28.69 mV,最小差值的均值分别为5.78、8.12和12.71 mV。1、5和10 μg·mL-1台湾脂素E分别处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后,根冠、分生区、成熟区线粒体氧化还原电位变化量差异不显著,伸长区线粒体氧化还原电位差异显著。

2.4 不同浓度氟乐灵对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

从图6可知:氟乐灵处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后能够显著降低其分生区线粒体氧化还原电位,且电位变化差值与化合物氟乐灵的浓度大小有关。1、5和10 μg·mL-1氟乐灵分别处理拟南芥15 min后,其分生区线粒体氧化还原电位变化最大差值的均值分别为5.66、13.64和19.01 mV,最小差值的均值分别为1.25、8.96和15.20 mV。1、5和10 μg·mL-1氟乐灵分别处理mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株后,根冠、分生区、伸长区以及成熟区线粒体氧化还原电位变化均出现显著差异性。

图6 不同浓度氟乐灵对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响Fig.6 Effects of different concentrations of trifluralin on the redox potential of root cells of A.thaliana

3 讨论

本文在mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根尖细胞中检测到mt-roGFP1探针能响应外源化合物H2O2和DTT引起的氧化还原状态变化,验证了mt-roGFP1探针的灵敏性和可逆性。用H2O2处理拟南芥时,mt-roGFP1探针被氧化,其荧光强度比值升高,用DTT处理时,mt-roGFP1探针被还原,荧光强度比值降低,证明mt-roGFP1探针能够响应组织中氧化还原状态的改变,与前人的研究结果一致[2,11]。

研究发现,外源化合物(氯化钠等)、干旱、高温或低温等非生物逆境会使植物细胞氧化还原电位产生变化[12-14]。目前,研究具有除草活性的外源化合物对植物细胞氧化还原电位影响的研究较少。本试验利用mt-roGFP1荧光探针技术,研究秃杉素、台湾脂素E和台湾脂素H对拟南芥植株根尖细胞线粒体氧化还原电位影响的结果表明,这些化合物均可以显著降低mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根部分生区氧化还原电位,且在一定范围内,随着化合物浓度的增大,其对mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根部分生区氧化还原电位的影响也大。这3种化合物与对照组氟乐灵处理结果相比,其氧化还原电位差值整体呈增大趋势,而对照组呈下降趋势,这可能是由于该3种化合物与氟乐灵的作用机制不同导致的。另外,台湾脂素E与台湾脂素H处理后拟南芥根部氧化还原电位变化趋势一致,这可能是由于两者化学结构相似导致作用效果相似。不同浓度台湾脂素H处理后,拟南芥根部各分区氧化还原电位变化均出现显著性差异,而不同浓度台湾脂素E处理后,只有伸长区氧化还原电位出现显著性差异,两者之间存在一定差异,这有待进一步研究。

植物中活性成分的提取流程较为复杂且一般提取量少,而常规的测试活性方法速度慢且需求量较大[15-16],对其作用机制研究过程更是复杂,因此较难进行活性测试和成分鉴定,而借助roGFP1荧光探针技术可在短时间(15 min)内以更少的药剂量进行快速的活性测定。

综上,在一定范围内,秃杉素、台湾脂素H和台湾脂素E浓度越高,mt-roGFP1标记的拟南芥转基因植株根尖细胞氧化还原电位值及变化越大,表现出剂量效应关系,且分生区的效应更加明显和敏感,因此可选分生区为主要研究区域。本研究结果对利用roGFP1荧光探针技术研究新型植物源除草剂对根系细胞线粒体的作用机制研究提供了基础,同时为建立除草活性化合物快速筛选平台提供理论依据。