VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

张晓雯,宣旭娴,白云赫,王霏,吴伟民,王壮伟,董天宇,张川,房经贵,王晨*

(1.南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院果树研究所,江苏 南京 210014)

葡萄(VitisviniferaL.)是在全球范围种植的多年生高经济效益果树,其广泛应用于鲜食、制干、饮料等方面,因而在人们的饮食健康中扮演着重要角色。其中,无核葡萄因食用方便,或制干、制罐中无需去核等特点深受消费者和加工者青睐,其相关研究也备受关注,但其无核的分子机制目前尚不清楚。单性结实是形成无核葡萄的重要途径,主要包括自然单性结实、刺激性单性结实和假单性结实(种子败育)3种类型,目前栽培的无核葡萄品种约80%来自种子败育。近年来,围绕葡萄种子败育的研究主要集中在生理机制、败育相关影响因子和胚挽救技术等方面,而其败育的分子机制尚不明确。

miRNA是一类新的内源非编码RNA,其可通过调控靶基因表达参与植物生长发育、响应激素和胁迫等多种过程[1-3]。据报道,miR396-GRF(growth-regulating factor)模块的调控作用在种子植物中较为保守[4],但其功能具有多样性。目前,在水稻[5]、烟草[6]、番茄[7]、拟南芥[8-10]、小麦[11]、杨树[12]、苹果[13]等多种物种上已有该模块的报道,主要集中在miR396介导GRF调控植物生长发育和抗逆胁迫等方面。烟草miR396通过负调控GRF来介导叶形态发育,并可提高烟草的抗旱性[6];番茄miR396介导靶基因GRF参与调控果实质量、心室数、光泽度、果皮厚度、萼片长度和宽度[7];杨树miR396-GRF通过介导微调细胞增殖和扩增进而调控叶片大小[12];苹果miR396参与调控果实发育,且在不定根诱导和根系伸长中也发挥关键作用[13]。近期研究发现,miR396-GRF可以通过生长素途径参与拟南芥种胚[9]和葡萄花序结构[14]的调控,以及水稻籽粒大小与稻瘟病抗性的调控[5,15]。研究表明miR396-GRF可能在种子籽粒发育中起着重要作用[5,9],但有关其在葡萄种子发育/败育中的作用尚未见报道。

尽管已在多个物种上开展miR396研究,但由于表达及其作用模式具有物种或时空特异性,其在葡萄中的作用模式有待进一步鉴定。已有研究表明miR396在种子籽粒发育中起着重要作用,但其在种子败育方面的作用并不清楚,而我们前期初步研究发现其在葡萄种子败育的关键期具有高表达,推测其可能参与该过程的调控。为了验证该假说,本研究首先在葡萄中鉴定了VvmiR396的精确序列,预测并验证其真实的靶基因及其在种子败育中的裂解作用模式,再通过生物信息学分析其序列的进化保守性,并通过启动子作用元件分析预测其潜在的功能,综合比较分析VvmiR396及其靶基因VvGRF在有核和无核葡萄品种中的时空表达差异,以及VvmiR396-VvGRF1表达相关性,初步认识VvmiR396及其靶基因在葡萄种子败育/发育的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种胚败育型葡萄品种‘京可晶’和有核葡萄品种‘魏可’取自江苏省农业科学院葡萄科研基地。选取生长势基本相同的花序,在花后1 d(1 DAF)、7 d(7 DAF)、14 d(14 DAF)、28 d(28 DAF)和 42 d(42 DAF)分别采集葡萄果实,将种子/种子区(种胚败育果实中与对照组种子相对应的组织部位)剥离后立即放入液氮中速冻,于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 VvmiR396 成熟体序列克隆及前体鉴定

通过miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库获取葡萄miR396家族(VvmiR396)的成熟体序列,用Primer 3 Input(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)软件设计扩增引物(表1)。选择miR-RACE技术[16]进行基因扩增,PCR产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收,送公司测序。

表1 引物序列及其用途Table 1 Sequence and usage of primers

1.3 VvmiR396 的靶基因预测

葡萄VvmiR396的靶基因通过psRNA Target(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)进行预测,且提交的小RNA/预载转录本中最大期望值(maximum expectation)为3.0。将预测到的序列在葡萄基因数据库CRIBI(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php)进行比对和功能注释。

1.4 VvmiR396 的靶基因验证

1.4.1 RLM-RACE和PPM-RACE定位mRNA切割位点使用本课题组早期改良的RLM-RACE和开发的PPM-RACE技术确定VvmiR396介导靶基因的3′和5′末端剪切产物。根据Wang等[17]的方法,将HMW RNA添加到Poly(A)并使用T4-RNA连接酶连接到5′衔接子(5′-CGACUGGAGCACGAGGA-CACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3′),通过苯酚/氯仿提取,乙醇沉淀回收Poly(A)-尾HMW RNA和衔接子连接的HMW RNA。将Poly(A)-尾HMW RNA和衔接子连接的HMW RNA进一步反转录成PPM-RACE和RLM-RACE的cDNA。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和测序。

1.4.2 烟草共转化活体验证构建VvMIR396b-pBI121、VvGRF1-pBI121、mVvGRF1-pBI121(VvGRF1基因中VvmiR396b靶区前的基因片段)、VvGRF10-pBI121、mVvGRF10-pBI121(VvGRF10基因中VvmiR396b靶区前的基因片段)表达载体,转化农杆菌备用。选取4周龄的本氏烟草植株进行农杆菌注射(于两叶脉之间侵染)。注射完毕后黑暗培养,第3天进行组织化学染色。用打孔器将烟草叶片打孔后浸泡到GUS染液中,放入真空过滤器,真空泵30 min。取出样品,放入37 ℃的培养箱中过夜染色。染色结束后将一部分烟草叶片放在液氮中研磨成粉,使用Jia等[18]的方法进行GUS活性检测。其余染色叶片剔除染色液,加入足够的75%乙醇溶液,放入65 ℃水浴锅中脱色,不断更换脱色液(75%乙醇溶液)直到样本变白,观察脱色完成的样品并拍照。

1.5 VvmiR396 及其靶基因的生物信息学分析

用Bio XM软件对VvmiR396序列进行比对分析;并利用在线软件RNA Folding Form V2.3(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form-v2.php)预测分析VvmiR396前体的二级结构。用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)绘制VvmiR396的染色体定位图;在MEGA 6.0软件中,选择邻近法且Bootstrap为1 000,构建包括葡萄在内的13个植物miR396的系统进化树,运用Chiplot(https://www.chiplot.online/)对进化树进行优化。利用Clustal 2.0软件分析不同物种miR396成熟序列碱基的保守性。

VvGRF1的系统进化与基因序列结构分析工具为MEGA 6.0软件和Gene Structure Display Server(GSDS)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php);VvGRF1蛋白的保守基序与保守结构域分析分别在MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)和SMART(http://smart.embl.de/)上完成。

1.6 葡萄VvmiR396及其靶基因VvGRF1的启动子作用元件分析

通过葡萄基因组数据库CRIBI(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php)和Grape Genome Browse(http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)预测下载VvMIR396(VvmiR396前体基因)和VvGRF1基因的启动子序列,在Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上获取启动子作用元件分析结果。

1.7 VvmiR396及其靶基因的表达特性及相关性分析

采用CTAB法[19]提取不同时期‘魏可’和‘京可晶’种子区的RNA,反转录为cDNA,以不同时期的cDNA为模板,采用实时定量 PCR(RT-qPCR)检测VvmiR396前体基因和VvGRF1的相对表达量。扩增体系及程序按照 SYPBR PremixExTaqTM试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书进行,每个样品3个重复。用SPSS 19.0软件进行数据统计及差异显著性分析,使用GraphPad Prism软件绘图。

2 结果与分析

2.1 ‘京可晶’和‘魏可’葡萄果实发育过程中的形态学分析

通过对比种胚败育型葡萄品种‘京可晶’和有核品种‘魏可’的果实(图1-A)和胚珠(图1-B)的外观形态和纵横径(图2)发现,花后1 d,‘京可晶’和‘魏可’的胚珠均正常发育且大小相差无异;花后7～28 d,‘京可晶’的胚珠仍可正常发育,而在花后28 d后,‘京可晶’胚珠发育不良,逐渐缩小退化,未能形成正常的种子;而‘魏可’的胚珠发育正常最终形成成熟种子。推测‘京可晶’的种胚败育自花后28 d开始,花后28～42 d可能是胚败育的关键时期。

图1 ‘京可晶’和‘魏可’葡萄生长发育图Fig.1 Growth and development diagram of ‘Jingkejing’and ‘Wink’grapesA.‘京可晶’和‘魏可’葡萄浆果发育图;B.‘京可晶’和‘魏可’葡萄胚珠发育图。A. The berry development diagram of ‘Jingkejing’and ‘Wink’grapes;B. The developmental diagram of the ovules of the ‘Jingkejing’and ‘Wink’grapes.

图2 ‘京可晶’和‘魏可’葡萄果实及种子纵横径变化Fig.2 Variation of vertical and horizontal diameters of fruit and seed of ‘Jingkejing’and ‘Wink’grapes

2.2 VvmiR396及其前体基因序列的鉴定

利用miR-RACE共鉴定了VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c/d 3条成熟体序列,它们的序列与miRBase(http://www.mirbase.org/)中的数据序列相似性100%。除VvmiR396b为20 bp以外,其他均为21 bp,VvmiR396a、VvmiR396c/d比VvmiR396b在3′末端多1个碱基,且VvmiR396a的3′末端碱基为A,VvmiR396c/d的3′末端碱基为G(图3-A)。进一步克隆鉴定了VvmiR396家族4个成员的前体基因,序列长度分别为657、651、648和669 bp(图3-B),通过RNA Folding Form V2.3软件预测VvmiR396前体序列的二级结构发现,4条miRNA的前体序列均可形成典型的茎环结构,且其成熟体序列均位于茎环结构的5′臂上,这表明VvmiR396在葡萄中可稳定存在(图3-C)。利用MG2C软件对其染色体定位,结果显示VvmiR396家族4个成员分布在3条葡萄染色体上,VvmiR396b和VvmiR396d分布于葡萄11号染色体上,VvmiR396a位于葡萄9号染色体上,VvmiR396c位于葡萄4号染色体上(图3-C)。VvmiR396c和VvmiR396d成熟体序列相同,却分布在不同染色体上;而VvmiR396b和VvmiR396d成熟体序列不同,却分布在相同的染色体上,表明miRNA染色体位置保守性与其成熟体序列保守性并非完全一致。

图3 VvmiR396 序列鉴定和染色体分布Fig.3 Sequence identification and chromosomal distribution of VvmiR396A. VvmiR396a/b/c/d 成熟体序列;B. VvmiR396a/b/c/d 前体基因扩增(M. Marker;a. VvMIR396a;b. VvMIR396b;c. VvMIR396c;d. VvMIR396d);C. VvmiR396 前体的二级茎环结构及其在染色体上的定位。A. VvmiR396a/b/c/d mature sequence;B. VvmiR396a/b/c/d precursor gene amplification(M. Marker;a. VvMIR396a;b. VvMIR396b;c. VvMIR396c;d. VvMIR396d);C. Secondary stem-loop structure of the VvmiR396 precursor and its localization on the chromosome.

2.3 VvmiR396成熟体序列的同源保守性及进化分析

对烟草、番茄、水稻、拟南芥等13种植物的miR396成熟体进行同源保守性及进化分析(图4-A)发现,不同物种的miR396具有保守性,特别是在5′端第4、18、20位碱基高度保守,第4位碱基均为C,第18和20位均分别为G、A,osa-miR396f的5′端第1位比其他miR396多1个U,并且除小麦(tae-miR396)外,其他miR396成熟序列5′端碱基均以“U”开头,这意味着miR396生源合成机制在这些物种中保守。vvi-miR396c/d和csi-miR396a/b成熟体序列完全相同,表明其可能具有相同的生物学功能。不同物种的miR396家族成员的数量也不同,小麦miR396家族仅有1个成员,拟南芥、番茄和桃等物种均有2个成员,而烟草(3个)、葡萄(4个)、草莓(5个)、甜瓜(5个)、柑橘(6个)、苹果(7个)、毛果杨(7个)、玉米(8个)和水稻(9个)等物种的miR396家族均有多个成员。从进化图谱(图4-B)中发现,vvi-miR396a、vvi-miR396b、vvi-miR396c、vvi-miR396d聚集在同一分支上,vvi-miR396和烟草、番茄等物种同源序列的亲缘关系较近,与小麦的亲缘关系较远。

图4 VvmiR396成熟体序列比对及进化分析Fig.4 Sequence alignment and evolution analysis of VvmiR396 mature sequenceA. miR396a/b/c/d 成熟体序列比对Alignment of miR396a/b/c/d mature sequence;B. miR396a/b/c/d成熟体序列进化分析Evolution analysis of miR396a/b/c/d mature sequence.vvi:葡萄Vitis vinifera;ppe:桃Prunus persica;zma:玉米Zea mays;tae:小麦Triticum aestivum;osa:水稻Oryza sativa;nta:烟草Nicotiana tabacum;sly:番茄Solanum lycopersicum;ptc:毛果杨Populus trichocarpa;csi:柑橘Citurs sinensis;mdm:苹果Malus domestica;cme:甜瓜Cucumis melo;ath:拟南芥Arabidopsis thaliana;fve:草莓Fragaria vesca.

2.4 VvmiR396的靶基因预测与靶裂解验证

2.4.1 VvmiR396的靶基因预测及其序列匹配程度分析利用psRNA Target工具预测VvmiR396的靶基因,VvmiR396家族不同成员均有相同的靶基因VvbZIP16、VvPK2、VvEMS1、VvGRF1、VvGRF3、VvGRF4、VvGRF8、VvGRF10,且抑制方式均为裂解作用(表2)。进一步对VvmiR396及其靶基因的匹配程度研究发现,VvbZIP16、VvPK2、VvEMS1与VvmiR396的匹配程度均低于VvGRF,VvmiR396a/b/c/d对于不同的VvGRF匹配程度也不同。虽然VvmiR396a和VvmiR396b的成熟体序列不同,但都与VvGRF1存在2个错配碱基,且VvmiR396c/d与VvGRF1存在3个错配碱基(图5)。同一个VvmiR396对于不同的VvGRF靶裂解区可能完全相同,VvmiR396a对于VvGRF4和VvGRF8的裂解区碱基相同,且VvmiR396b/c/d也类似,说明VvmiR396家族成员与其靶基因之间的作用强度和裂解靶区都存在一定差异。我们前期初步研究发现VvmiR396及其靶基因在假单性结实葡萄种子败育中有特异表达,推测它们可能在假单性结实过程中发挥重要作用。本试验进一步对VvmiR396b对于VvGRF1和VvGRF10的裂解作用展开研究。

2.4.2 VvmiR396及其靶基因裂解验证通过RLM-RACE、PPM-RACE和活体验证鉴定VvmiR396对VvGRF1和VvGRF10的裂解作用。RLM-RACE和PPM-RACE分别鉴定3′末端和5′末端裂解产物(图6-A),VvmiR396a/b/c/d均可裂解VvGRF1,裂解位点为miRNA 5′端的第10和第11位,RLM-RACE裂解频度为19/22和2/22,PPM-RACE裂解频度为5/25和2/25;VvmiR396a/b/c/d裂解VvGRF10的位点为miRNA 5′端的第9和11位,RLM-RACE裂解频度为17/21和2/21,PPM-RACE裂解频度为3/20和 1/20。利用烟草瞬时共转化技术(载体示意图见图6-B)研究了VvmiR396b与VvGRF1、VvGRF10之间的体内相互作用。烟草叶片35SCaMV∷GUS、35SCaMV∷VvGRF1-GUS、35SCaMV∷mVvGRF1-GUS、35SCaMV∷VvGRF10-GUS和35SCaMV∷mVvGRF10-GUS中均有GUS表达。而烟草叶片35SCaMV∷VvMIR396b中未检测到GUS表达。35SCaMV∷VvGRF1-GUS和35SCaMV∷VvMIR396b共转的叶片中GUS表达显著下调,35SCaMV∷VvGRF10-GUS和35SCaMV∷VvMIR396b共转的叶片中GUS表达也有所下调,但下调程度不及35SCaMV∷VvGRF1-GUS和35SCaMV∷VvMIR396b共转的叶片,而35SCaMV∷mVvGRF1-GUS和35SCaMV∷VvMIR396b以及35SCaMV∷mVvGRF10-GUS和35SCaMV∷VvMIR396b共转的叶片中GUS表达无明显差异(图6-C)。这些结果表明,35SCaMV∷VvMIR396b通过碱基互补配对抑制了35SCaMV∷VvGRF1-GUS和35SCaMV∷VvGRF10-GUS叶中的GUS表达。GUS表达活性分析结果与组织化学观察结果一致(图6-D),该试验结果从分子和生理两方面共同证明了VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396家族真实的靶基因,而相比于VvGRF10,VvmiR396对于VvGRF1的裂解作用更强,故本试验重点对靶基因VvGRF1(VIT_218s0001g08650.1)开展研究,分析VvmiR396介导VvGRF的调控作用。

图6 VvmiR396对靶基因VvGRF裂解的验证Fig.6 Verification of the cleavage of its target gene VvGRF by VvmiR396A.VvmiR396对靶基因VvGRF1和VvGRF10的裂解位点示意图;B.共转化的载体示意图;C.烟草共转化叶片GUS染色;D.烟草叶片GUS活性。A. Schematic diagram of the cleavage site of VvmiR396 to target genes VvGRF1 and VvGRF10;B Schematic diagram of co-transformed vector;C. GUS staining of tobacco co-transformed leaves;D. GUS activity of tobacco leaves.

2.5 VvGRF1的序列进化及保守性分析

2.5.1 GRF1 序列结构及进化分析分别利用MEGA 6.0和Gene Structure Display Server(GSDS)对VvGRF1进行进化分析与内含子/外显子结构分析(图7-A)发现,ZjGRF1、MdGRF6、PpGRF1、PaGRF1分布在第2主支上;而其他7个物种的GRF聚集为一组。VvGRF1基因与PeGRF1、PtGRF1、NnGRF6、NtGRF1等物种的亲缘关系较近,与DzGRF1、CiGRF1的亲缘关系较远。不同物种的GRF基因结构也存在一定差异,除枣的GRF1(ZjGRF1)含有5个外显子和4个内含子外,其他物种(包括葡萄在内)的GRF1均含有3个内含子、4个外显子。

图7 GRF1 结构与进化保守性分析Fig.7 Sequence structure and evolutionary conservation analysis of GRF1A. GRF1基因结构与进化分析Gene structure and evolutionary analysis of GRF1;B. GRF1蛋白motif分析The motif analysis of GRF1;C. GRF1保守结构域分析The analysis of conserved domain of target gene GRF1.Vv:葡萄 Vitis vinifera;Dz:榴莲Duriozibethinus;Ci:山核桃Carya cathayensis;Zj:枣Ziziphus jujuba;Pt:毛果杨Populus trichocarpa;Nn:荷花Nelumbo nucifera;Pe:胡杨Populus euphratica;Pp:桃Prunus persica;Pa:樱桃Cerasus pseudocerasus;Md:苹果Malus domestica;Nt:烟草Nicotiana tabacum.

2.5.2 GRF1 蛋白作用元件及保守结构域分析分析GRF1蛋白保守基序(图7-B)发现,VvGRF1与其他10个物种GRF蛋白的作用元件有较高保守性,且其排列顺序以及数量高度一致。利用SMART预测GRF1蛋白保守结构域(图7-C)发现,VvGRF1蛋白和其他10个物种GRF蛋白均含有QLQ和WRC 2个保守结构域,且2个结构域的排列顺序完全一致,表明VvGRF1蛋白与其他物种氨基酸序列和结构域保守性较高,这为GRF1蛋白在不同物种中存在相似功能提供了有力证据。

2.6 VvMIR396及其靶基因VvGRF1的启动子顺式作用元件分析

2.6.1VvMIR396的启动子顺式作用元件分析通过对VvMIR396(VvmiR396的前体基因)启动子分析发现,在VvMIR396启动子中有4类主要作用元件,分别是光响应作用元件、激素作用元件、胁迫相关作用元件和组织特异性元件(图8)。4个成员中,VvMIR396d启动子上的作用元件数量最多,共有32个;除VvMIR396b启动子含有组织(种子)特异性元件外,其余成员的启动子均仅含有其余3类作用元件;除VvMIR396d启动子外,其余成员的启动子均有胁迫相关作用元件。VvMIR396启动子中都有较多的光响应作用元件:VvMIR396a启动子中有11个,VvMIR396b有8个,VvMIR396c有13个,VvMIR396d有17个,这可能与植物进行光合作用密切相关。4个VvMIR396启动子上激素响应元件的种类和数量也各有差异,VvMIR396a启动子上有2个赤霉素响应元件和1个脱落酸响应元件,VvMIR396b启动子上的激素响应元件为生长素(1个)、赤霉素(3个)、细胞分裂素(1个)、脱落酸(4个)、茉莉酸甲酯(2个)。VvMIR396c启动子上只有1个生长素响应元件。VvMIR396d启动子上有6个茉莉酸甲酯响应元件、8个生长素元件和1个水杨酸元件,说明VvmiR396成员可能分别参与不同的激素信号通路调控,而只有VvMIR396b启动子上含有5个种子特异性表达密切相关的顺式作用元件,进一步说明VvmiR396特别是VvmiR396b在种子发育过程中可能起着关键的作用。

2.6.2 靶基因VvGRF1的启动子顺式作用元件分析通过Plant CARE对VvmiR396的靶基因VvGRF1的启动子分析发现,VvGRF1的启动子中有3类主要作用元件:光响应作用元件、激素作用元件和胁迫相关作用元件(表3)。其中,光响应作用元件8个,胁迫相关作用元件3个,激素作用元件9个。胁迫作用元件中包括2个低温响应元件和1个防御应激响应元件;激素作用元件中,脱落酸响应元件最多,有5个,生长素和赤霉素响应元件各1个,茉莉酸甲酯响应元件2个。因此,VvGRF1可能通过响应不同激素信号进而参与生长发育等过程的调控。

综合VvmiR396及其靶基因VvGRF1启动子分析的结果,推测VvmiR396和VvGRF1可能通过响应不同激素信号通路参与葡萄种子发育过程的调控。此外,VvGRF1可能也参与胁迫响应特别是对于低温胁迫的响应。

2.7 VvmiR396 及靶基因在葡萄种胚败育/种子发育的时空表达特征及作用模式

如图9-A所示:在‘京可晶’种子败育过程中,VvmiR396表达量逐渐升高,在种子败育关键时期28～42 d高表达,靶基因VvGRF1表现为相反的表达趋势,在种子败育关键期呈现低表达;在有核品种‘魏可’种子中,VvmiR396的表达量逐渐降低,而VvGRF1的相对表达量逐渐升高(图9-B)。在‘京可晶’和‘魏可’中VvGRF1的表达量与VvmiR396均呈负相关,且两者的相对表达量变化呈相反趋势,这说明VvmiR396可能在假单性结实品种种胚败育过程中起到重要的调控作用。对靶基因的作用模式分析(图9-C)表明,在‘京可晶’和‘魏可’中,VvmiR396-VvGRF1都呈显著负相关,但相关性系数存在差异,表明VvmiR396-VvGRF1的作用强弱存在一定的差异。‘京可晶’中的模块有VvmiR396a-VvGRF1(r=-0.982)、VvmiR396b-VvGRF1(r=-0.998)、VvmiR396c-VvGRF1(r=-0.976)、VvmiR396d-VvGRF1(r=-0.973),其中VvmiR396b-VvGRF1存在最大的负相关性,表明其可能是参与葡萄种胚败育调控的重要模块。

3 讨论

大量研究表明,miRNA在转录后通过与mRNA靶标碱基匹配调控靶基因的表达。许多植物miRNA可能靶向转录因子,通过裂解其靶标从而调节靶基因的表达,在植物各个发育阶段发挥调控作用[20-22]。据报道,miR396能够靶向和转录后调节GRF基因,且miR396-GRF模块在不同物种中的作用是保守的[23-27]。

众多研究表明,miR396参与籽粒大小调控[24-27]。Che等[24]研究表明,OsmiR396可以调控GRF4,进而调控水稻粒长相关基因GL2,提高水稻颗粒重,从而提高水稻产量。另外,OsmiR396可以调控GRF4并编码与水稻籽粒大小相关的新的QTL[25]。在小麦籽粒发育过程中,miR396的表达呈逐渐下降趋势,靶基因GRF1、GRF6和GRF9呈上升趋势,验证了miR396通过调节GRF的表达参与籽粒发育[26],而在我们的研究中也得到类似结果,有核品种‘魏可’种子中VvmiR396的表达量逐渐降低,而VvGRF1的相对表达量逐渐升高。在蓖麻中的研究同样也表明miR396-GRF可能参与调控籽粒发育过程[27]。本研究结果表明,VvmiR396b可能通过介导VvGRF1表达负调控‘魏可’种子的发育。

另有研究者发现,在拟南芥中,过表达miR396导致植株叶片变窄,花柱头弯曲和角果结实率降低,表明miR396-AtGRF在拟南芥叶片及花果发育过程中起着重要调控作用[28]。miR396b-OsGRF6通过生长素合成和信号传导参与早期花序的形成,进而影响水稻的产量。番茄miR396及其靶基因GRF2、GRF3、GRF4及GRF5主要参与调控番茄果实的生长发育,并且影响细胞壁代谢,植物激素IAA、GA及乙烯相关基因的表达[7]。这些研究表明miR396-GRF可以通过应答激素信号通路调控植物花果及种子的发育。本研究也有类似的发现,VvMIR396及其靶基因VvGRF的启动子均含有多个激素响应的作用元件,表明它们可能通过响应激素信号调控葡萄生长发育。此外,火龙果中hpo-miR396b及靶基因HpGRF6在应对逆境时均做出了不同程度的响应[29]。在本研究中我们发现VvmiR396及其靶基因VvGRF1的启动子也含有低温响应元件。火龙果HpGRF6的表达量与miR396b均呈负相关,表明miR396b在非生物胁迫过程中通过负调控HpGRF6表达,本研究通过裂解验证试验也证明了VvmiR396b对靶基因的负调控作用。

尽管miR396在拟南芥、番茄、水稻等模式植物上的研究不断深入,但对于其在葡萄假单性结实方面的研究尚未见报道。我们前期的研究鉴定了许多已知葡萄浆果发育过程中的特异miRNA,其中很多miRNA参与果实发育和种子形成的调控过程[30-35]。本研究结果显示:在‘京可晶’种子败育过程中,VvmiR396的表达量逐渐升高,且在花后42 d表达量最高,靶基因VvGRF1呈现相反表达模式;相比在有核品种‘魏可’种子发育中,VvmiR396呈现下降的趋势,在花后42 d表达量最低,靶基因呈现相反的表达模式,表明VvmiR396可能介导VvGRF1负调控种子的发育;进一步相关性分析表明,在‘京可晶’种子败育中,VvmiR396b与VvGRF1的相关性最高,表明VvmiR396b对VvGRF1具有最强的负调控作用,VvmiR396b可能通过负调控VvGRF1介导葡萄种胚败育。这不仅丰富了葡萄假单性结实表观调控的理论内容,也为深入探讨VvmiR396及其靶基因调控葡萄种胚败育分子机制提供了重要的参考。