基于IL-6/miR-155轴探讨溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的影响

陈凯，朱莹，周牧之

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）主要临床特征包括大便带血、腹部疼痛，以及大便形状、质地等改变。肠黏膜损伤和溃疡形成是UC常见病理表现，好发于直肠与乙状结肠，也可延伸至降结肠甚至整个结肠[1]。UC在我国发病率逐年升高[2-3]，常用药物有5-氨基水杨酸、激素、生物制剂及免疫调节剂，约一半患者服药后症状有效缓解，但可能导致严重不良反应，如呕吐、贫血和全身水肿等。由于UC病因复杂、复发风险高，易伴发其他并发症，已成为临床亟需解决的难题。UC发病机制复杂，具体原因尚未完全明确。IL-6/miR-155轴在UC发生发展中发挥重要作用，白细胞介素（IL）-6通过作用于下游信号因子促进信号传导与转录激活因子（STAT）3磷酸化，STAT3磷酸化入核后能诱导miR-155表达，进一步调控UC炎症反应及Th17/Threg平衡[4-6]。溃结宁膏是朱莹教授根据多年临床经验所创，课题组运用溃结宁膏穴位敷贴治疗脾肾阳虚型UC临床疗效显著[7]。前期实验研究表明，溃结宁膏能减轻UC大鼠及细胞模型炎症反应，降低肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1等促炎因子分泌[8-9]。本实验在前期研究基础上，观察溃结宁膏穴位敷贴对UC大鼠炎症反应及Th17/Threg平衡的影响，进一步阐明其治疗UC的分子机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验有限公司。饲养于湖南中医药大学第一附属医院动物房，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，12 h光暗循环，自由摄食饮水。本实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（ZYFY20190814-1）。

1.2 药物、试剂及仪器

溃结宁膏（由炮附子、延胡索、丁香、芥子、赤芍、细辛、生姜按1∶1∶1∶1∶1∶1∶2组成）、无药物巴布剂基质（由聚丙烯酸钠、高岭土、明胶、甘羟铝、聚乙烯醇、蓖麻油、甘油组成），湖南省中医院药剂科提供。柳氮磺嘧啶（SASP）片，批号09190501，上海信谊天平药业有限公司。番泻叶，湖南然润堂中药有限公司。

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批号2297，美国Sigma公司），腺嘌呤（批号A8626-25G，美国Sigma公司），大便隐血试剂（批号C027-1-1，珠海贝索生物技术有限公司），IL-8、IL-17、IL-23 ELISA试剂盒（批号分别为I03050436、I0303471、I040347110，武汉华美生物工程有限公司），mRNA反转录试剂盒（批号CW2569，北京康为世纪），miRNA反转录试剂盒（批号CW2141，北京康为世纪），p-STAT3一抗（批号ab76315，英国Abcam），IL-6一抗（批号ab233706，英国Abcam），CD4-FITC抗体（批号11-0040-82，美国Invitrogen公司），IL-17A-PE抗体（批号12-7177-81，美国Invitrogen公司），Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）500×（批号00-4975-93，美国eBiosciences公司），人外周血淋巴细胞分离液（批号P8610，北京索莱宝公司），红细胞裂解液（批号C3702，北京索莱宝公司），CD25-PE抗体（批号17-0390-82，美国eBiosciences公司），Foxp3-APC抗体（批号12-5773-80，美国eBiosciences公司），β-actin抗体（批号66009-1-Ig，美国Proteintech），HRP标记山羊抗小鼠IgG（批号SA00001-1，美国Proteintech），HRP标记山羊抗兔IgG（批号SA00001-2，美国Proteintech）。

台式高速冷冻离心机（型号H1650R，湖南湘仪），多功能酶标分析仪（型号MB-530，深圳汇松科技发展有限公司），全自动酶标洗板机（型号PW-812，深圳市汇松科技发展有限公司），电热恒温培养箱（型号DHP-500，北京市永光明医疗仪器有限公司），荧光定量RCP仪（型号PIKOREAL96，美国Thermo），荧光PCR板（型号SPL0960，美国Thermo），摇床（型号TS-1，江苏其林贝尔），电泳仪（型号DYY-6C，北京六一），电泳槽（型号DYCZ-24DN，北京六一），转膜仪（型号DYCZ-40D，北京六一），-80 ℃冰箱（型号DW-HW438，中国美菱）。

1.3 造模

大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法选取12只大鼠正常喂养，剩余48只参照课题组前期方法[10]制备脾肾阳虚型UC大鼠模型，先予腺嘌呤10 mL/kg灌胃2周，第3周起用冰番泻叶溶液10 mL/kg灌胃，连续2周，期间自由摄食饮水，每日灌胃30 min后将冰水喷至大鼠毛发，使肌肉等全身各处湿透，再用风扇吹干。第29日大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg麻醉，用石蜡油润滑聚乙烯管后插入大鼠直肠，深度约8 cm，缓慢注入5%TNBS（100 mg/kg，加50%乙醇0.25 mL），提起大鼠尾巴倒置2 min。次日开始观察大鼠一般状况，随机取模型组4只、空白组1只过量麻醉处死，验证造模效果。造模后大鼠精神萎靡，毛发枯槁，体质量降低，进食减少，明显黏液脓血便，肉眼可见结肠组织局部溃疡、充血、糜烂，显微镜下可见中性粒细胞聚集，腺体排列紊乱，结合黏膜组织缺损提示造模成功。

1.4 分组及给药

将正常喂养的11只大鼠作为空白组，44只成模大鼠按随机数字表法分为模型组、非穴位敷贴组、穴位敷贴组和SASP组，每组11只。取穴参考《实验针灸学》[11]，选择“脾俞”“膈俞”“足三里”“大肠俞”“天枢”“肾俞”，模型组用无药物巴布剂基质敷贴穴位+生理盐水灌胃，穴位敷贴组用溃结宁膏敷贴穴位+生理盐水灌胃，非穴位敷贴组用溃结宁膏敷贴臀部肌肉丰厚处+生理盐水灌胃，SASP组用无药物巴布剂基质敷贴穴位+SASP灌胃，两侧穴位交替进行，1.5 h/次，1次/d，连续14 d。

1.5 取材

末次干预后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠10 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，3 500 r/min离心10 min，血清保存于-20 ℃备用。取血后脱颈处死大鼠，取距肛门6～10 cm结肠组织于多聚甲醛中固定，用于病理检测，另取部分结肠组织于-80 ℃保存备用。

1.6 指标检测

1.6.1 一般状况及疾病活动指数评分

观察大鼠一般状况（精神状态、毛发、大小便等），干预结束后对大鼠进行疾病活动指数（DAI）评分，DAI=（体质量下降分数+大便性状分数+便隐血分数）÷3。具体评分标准见表1。

1.6.2 结肠组织病理形态观察及结肠黏膜损伤评分

取病变部位结肠组织，于多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，60 ℃烤片12 h，切片脱蜡至水，苏木精染色1～10 min，伊红染色1～5 min，脱水，烤干，封片。显微镜下观察结肠组织病理变化，并进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分。评分标准见表2[12]。

表2 CMDI评分标准

1.6.3 ELISA检测

按试剂盒说明书配制标准品、洗液工作液、生物素标记抗体工作液及辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。将试剂在室温平衡30 min，设置标准孔与待测样品孔，加样，弃液，加生物素标记抗体工作液，弃液，加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，弃液，甩干，加底物，避光显色，加终止液终止反应。用酶标仪测定波长450 nm处光密度（OD值），根据样品OD值计算血清IL-8、IL-17、IL-23含量。

1.6.4 RT-PCR检测

用Trizol、异丙醇、三氯甲烷、乙醇提取结肠组织总RNA，紫光分光光度计测定波长260 nm与280 nm吸光度，计算RNA浓度和纯度。配制反转录体系，将总RNA反转录为cDNA。PCR条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40个循环。引物序列见表3。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。

表3 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot检测

取结肠组织剪碎，加入RIRA裂解液，生物匀质仪匀浆，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，BCA法测定蛋白浓度。制备15%分离胶及4.8%浓缩胶，蛋白样品中加入loading buffer，煮沸，置于冰盒中备用。上样，75 V电泳130 min，300 mA恒流转膜，用脱脂奶粉室温封闭90 min。将膜与IL-6一抗（1∶750）、p-STAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000）于低温孵育过夜。次日室温放置30 min，加HRP-山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）、HRP-山羊抗兔IgG（1∶6 000）孵育60 min，ECL发光液进行显色，凝胶成像系统成像，Image J软件分析蛋白相对灰度值。

1.6.6 流式细胞术检测

取抗凝全血，加入淋巴细胞分离液，800×g离心30 min，吸取白膜细胞层，400×g离心5 min，用1640完全培养基重悬细胞备用。按1∶500稀释Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）后加入细胞悬液中，恒温培养箱培养4 h。收集细胞，用1×Fixation/Permeabilization concentrate重悬细胞沉淀，避光固定破膜30 min，加入1×工作液，反复离心，PBS重悬细胞沉淀，加入CD4、IL-17A、CD25和Foxp3抗体孵育，流式细胞仪上机检测。

1.7 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以-表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溃结宁膏对模型大鼠一般状况及疾病活动指数评分的影响

干预过程中除空白组外，其余各组均有大鼠死亡，分别为模型组3只、穴位敷贴组1只、非穴位敷贴组2只、SASP组1只，死亡时间主要集中在造模后1个星期内，考虑可能为结肠穿孔所致。

大鼠造模后精神状态变差，摄食量减少，毛发逐渐稀薄、干枯，体质量下降，形体消瘦，弓背蜷缩，喜扎堆，大便质地稀薄，部分夹杂黏液脓血，小便清长。与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠精神状态好转，毛发润泽，摄食量增加，体质量上升，大便逐渐成形，黏液脓血便程度减轻。

与空白组比较，模型组大鼠DAI评分明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠DAI评分明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠DAI评分比较（-，分）

表4 各组大鼠DAI评分比较（-，分）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

DAI评分组别只数0 2.67±0.33*2.50±0.22 1.00±0.26#△0.83±0.31#△空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组6 6 6 6 6

2.2 溃结宁膏对模型大鼠结肠组织病理形态的影响

空白组大鼠结肠组织表面光滑，呈淡粉白色，局部未见膨隆，结肠内壁未见溃疡、充血、水肿等表现；显微镜下腺体排列整齐，无炎性细胞浸润，未见细胞变性及坏死。模型组和非穴位敷贴组大鼠结肠长度不同程度缩短、结肠周径不一，局部可见红肿膨胀，部分肠段质地变硬，可见深浅不一的溃疡，黏膜局部红肿充血；显微镜下腺体排列紊乱，可见炎性细胞浸润及细胞变性、坏死。穴位敷贴组和SASP组大鼠结肠长度有所增加，结肠黏膜充血、水肿、溃疡明显好转，显微镜下腺体排列较前规则，细胞变性、坏死明显好转。见图1。

与空白组比较，模型组大鼠CMDI评分明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠CMDI评分明显降低（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠CMDI评分比较（-，分）

表5 各组大鼠CMDI评分比较（-，分）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

CDMI评分0 2.83±0.31*2.67±0.21 1.33±0.22#△1.17±0.17#△组别空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组只数6 6 6 6 6

2.3 溃结宁膏对模型大鼠血清白细胞介素-8、白细胞介素-17、白细胞介素-23含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明显增加（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明显减少（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比较（-，pg/mL）

表6 各组大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比较（-，pg/mL）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

只数IL-23组别IL-8IL-17 0.88±0.02 3.93±0.08*3.74±0.26 1.39±0.12#△1.21±0.09#△空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组4 4 4 4 4 24.50±0.58 63.09±2.02*58.35±1.06 31.21±0.42#△28.43±2.43#△605.62±3.65 997.14±14.60*979.33±6.73 656.92±19.22#△645.71±16.22#△

2.4 溃结宁膏对模型大鼠结肠组织白细胞介素-6、白细胞介素-17、白细胞介素-23、miR-155、信号传导与转录激活因子3 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表达明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠结肠组织IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表达明显降低（P＜0.05）。见表7。

表7 各组大鼠结肠组织IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表达比较（-）

表7 各组大鼠结肠组织IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表达比较（-）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

STAT3 0.99±0.15 4.73±0.52*4.08±0.33 1.45±0.12#△1.32±0.31#△组别空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组只数5 5 5 5 5 IL-6 0.47±0.08 2.45±0.15*2.00±0.14 0.88±0.18#△0.88±0.16#△IL-17 0.76±0.06 3.25±0.28*2.85±0.21 1.09±0.11#△1.11±0.07#△IL-23 0.66±0.10 3.85±0.18*3.65±0.19 1.15±0.15#△1.17±0.06#△miR-155 0.48±0.06 2.50±0.18*2.23±0.22 0.88±0.09#△0.93±0.12#△

2.5 溃结宁膏对模型大鼠结肠组织白细胞介素-6、磷酸化信号传导与转录激活因子3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图2、表8。

图2 各组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白免疫印迹

表8 各组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白表达比较（-）

表8 各组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3蛋白表达比较（-）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

p-STAT3组别只数IL-6 0.15±0.02 0.55±0.04*0.53±0.03 0.25±0.03#△0.25±0.02#△空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组5 5 5 5 5 0.17±0.02 0.56±0.04*0.53±0.03 0.24±0.03#△0.25±0.01#△

2.6 溃结宁膏对模型大鼠血液Th17、Treg细胞比例的影响

与空白组比较，模型组大鼠血液Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低（P＜0.05），Th17/Treg细胞比例明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位敷贴组比较，穴位敷贴组和SASP组大鼠血液Th17细胞比例降低，Treg细胞比例升高（P＜0.05），Th17/Treg细胞比例降低（P＜0.05）。见表9。

表9 各组大鼠血液Th17、Treg细胞比例比较（-）

表9 各组大鼠血液Th17、Treg细胞比例比较（-）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与非穴位敷贴组比较，△P＜0.05

组别空白组模型组非穴位敷贴组穴位敷贴组SASP组Th17/Treg 0.11±0.02 7.82±1.01*4.42±0.40#0.18±0.04#△0.22±0.03#△只数5 5 5 5 5 Th17/%1.79±0.31 13.85±1.01*12.37±0.67 2.27±0.37#△2.65±0.33#△Treg/%15.58±0.73 1.87±0.21*2.86±0.22 12.93±0.90#△12.58±1.02#△

3 讨论

根据UC临床症状，可将其归属于中医学“泄泻”“痢疾”等范畴，主要有湿热下注、脾肾阳虚、肝郁脾虚等类型[13]。本研究用SD大鼠制备动物模型，腺嘌呤灌胃2周后改为番泻叶灌胃。腺嘌呤具有肾毒性，常作为肾阳虚证的造模药物。番泻叶苦寒，伤脾肾之阳气，在灌胃同时进行环境干预，进一步损伤机体脾肾阳气，最后以TNBS和乙醇复合物灌肠制备脾肾阳虚型UC模型。该病证结合模型经前期研究证实可靠[10]。本研究发现，大鼠造模后出现活动迟缓、毛发枯槁、大便溏泻、便中带血等表现，结合肠道黏膜情况，提示造模成功。通过溃结宁膏穴位敷贴干预，能够有效改善模型大鼠一般状况。

UC发病机制复杂，主要与遗传、环境、菌群失调和免疫功能障碍相关。肠道炎症严重程度与促炎因子表达密切相关[14-15]。IL-6是由活化的免疫细胞产生的重要促炎因子，越来越多证据表明，IL-6水平能影响UC病情发展，改变疾病结局与预后。采用IL-6拮抗剂托珠单抗能减轻患者症状，缓解机体炎症反应[16-17]。IL-6能与其受体结合形成复合物，激活信号转导β受体gp130和细胞内信号级联通路，其中最重要的是JAK/STAT通路。gp130相关的Janus激酶（JAK）特别是JAK1在配体结合后被激活，从而使STAT3磷酸化入核，靶向miR-155转录。目前染色质免疫共沉淀已证实STAT3能够直接与miR-155位点结合，从而调节IL-6、IL-17、IL-23等炎症因子分泌。相反，miR-155通过JAK/STAT通路调节UC Th17/Treg平衡与炎症反应[5，18-19]。研究表明，IL-6/STAT3信号通路具有调节T细胞分化、免疫、肠道炎症的作用，阻断STAT3可调节机体免疫反应，缓解肠道炎症[20-21]。miR-155是具有不同功能的微小RNA，参与造血、炎症和免疫反应。炎症因子及Toll样受体能诱导miR-155表达，UC病变结肠组织miR-155表达升高，采用miR-155拮抗剂能降低其表达，减少炎症因子分泌，改善UC症状及体征[22-23]。以上研究表明，IL-6/miR-155轴在UC发展中扮演重要角色。本实验中模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量增加，结肠组织IL-6/miR-155轴关键因子IL-6、STAT3、miR-155表达升高，溃结宁膏干预能减少模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量，抑制IL-6/miR-155轴相关因子表达，调节Th17/Treg平衡。

穴位敷贴是常用医外治法，具有疗效显著、不良反应少、使用方便等特点，在临床广泛应用。在中西药内服基础上加用穴位敷贴能提高UC治疗效果，减轻药物不良反应，临床取穴主要为脾俞、肾俞、大肠俞、神阙等[24-25]。溃结宁膏依据脏腑经络理论选择穴位，采用药物外用刺激穴位，进一步通过经络将药效输送至相应部位，从而温补脾肾、调节气血。

综上，溃结宁膏可降低脾肾阳虚型UC大鼠DAI评分和CMDI评分，修复结肠组织损伤，其机制与减少炎症因子分泌，抑制IL-6/miR-155轴相关因子IL-6、p-STAT3、miR-155表达，调节Th17/Treg平衡有关。