预知子总皂苷大孔树脂分离纯化工艺优化及抗氧化活性研究*

杨 晨，武正华，石文清，吴江平，范国荣△

（1. 安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012； 2. 上海交通大学附属第一人民医院，上海 200940；3. 同济大学附属上海市第四人民医院，上海 200434）

预知子Akebiae Fructus为木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Dence、三叶木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz. 或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koide.var.austrlis（Diels）Rehd. 的干燥近成熟果实，又称“八月瓜”“八月炸”，广泛分布于江苏、浙江、安徽等地。预知子气微香，味苦，性寒，归胆、肝、胃、膀胱经，具有疏肝理气、活血止痛、散结、利尿等功效［1］。现代药理学研究表明，其主要含有三萜皂苷、绿原酸、黄酮等成分［2-3］，其中三萜皂苷作为预知子的主要成分，具有抗炎［4-5］、抗菌［6-7］、抗抑郁［8-9］、抗癌［10-12］等活性。另外，预知子中富含多种人体生长所需的营养成分，成熟后味甜。四川、云南等地将其作为水果食用，因其含有较多种子，部分地区也用其种子榨油，具有很好的开发前景［13］。随着三叶木通人工种植技术的不断成熟，以三叶木通为原料的产品开始进入大众视野，但其加工的产品还不能满足市场需求［14］。大孔树脂作为一类由有机高分子聚合物形成的具有网状结构的圆形吸附材料，具有成本低、无污染、提取效率高、可再生等优点，被广泛应用于化工、医药、食品等行业［15］。越来越多证据表明，氧化应激反应与人类多种疾病关系密切，故通过补充天然的抗氧化剂来平衡生物系统中的活性氧（ROS）水平具有重要意义［16］。而目前对预知子总皂苷抗氧化活性的研究较少，故本研究中使用大孔树脂对预知子提取物中三萜皂苷进行分离纯化，并研究其总皂苷的抗氧化活性，以期为预知子的药效物质基础及产品的深度开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

50 Conc型紫外分光光度计（美国Varian公司）；TS-1型摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；AUW220D型电子天平（日本Shimadzu 公司，精度为十万分之一）；RS-FS-1411型粉碎机（合肥荣事达电子电器集团有限公司）；R5005K2D 型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；pH计（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）。

1.2 试药

预知子（上海万仕诚国药制品有限公司，批号为20210728-2）；齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110709 - 202109，含量以95.8 %计）；D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS-7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔树脂（郑州和成新材料科技有限公司，批号为HC220619）；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH，北京华迈科生物技术有限公司，批号为D310202，含量不低于97%）；2，2 - 联氮- 二（3 - 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，上海源叶生物科技有限公司，批号为A02GS143434，含量不低于98%）；总抗氧化能力检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号为BC1310）；过硫酸钾、香草醛、高氯酸、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 预知子提取物溶液制备

取预知子，粉碎，过2号筛，按比例1∶20（m/V）加入85%乙醇，浸泡60 min，85 ℃回流提取3 次，每次1.5 h，滤过，取上清液，减压浓缩去乙醇，即得预知子提取物。加入适量水，配制质量浓度为100～800 mg/mL 的预知子提取物溶液，备用。

2.2 总皂苷含量测定［17］

取齐墩果酸对照品5.10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液；以甲醇为空白对照。精密量取上述对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，挥尽甲醇，精密加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.4 mL，充分摇匀，60 ℃水浴加热15 min，取出，冷却至室温，精密加入冰乙酸5 mL，摇匀，于540 nm 波长处测定吸光度。以对照品溶液质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.008X-0.010 6（R2=0.999 5，n= 6）。结果表明，总皂苷（以齐墩果酸计）质量浓度在9.11～54.64µg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.3 大孔树脂预处理

分别称取一定量的D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔树脂，在无水乙醇中浸泡24 h 后用纯水洗至无醇味，依次用5 倍体积4%盐酸溶液、纯水、4%氢氧化钠溶液淋洗，用纯水洗至中性，晾干，得各型号干树脂备用。

2.4 大孔树脂型号筛选

静态吸附试验：称取D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型干树脂各1.0 g，加入20 mL 质量浓度为400 mg/mL 的预知子提取物溶液，置100 mL 具塞锥形瓶中，密封，置摇床上（转速为150 r/min）振荡24 h，充分吸附，滤过，取一定体积吸附后的液体，按2.2项下方法测定滤液中总皂苷的含量，并计算不同型号大孔树脂对预知子总皂苷的吸附率，吸附率（%）=［（C0-C1）V1/W］× 100%。式中，C0为初始总皂苷质量浓度，C1为吸附后上清液中总皂苷质量浓度，V1为上样体积，W为树脂质量（干重）。详见表1。

表1 不同型号大孔树脂对预知子总皂苷的静态吸附和静态解析试验结果Tab.1 Static adsorption and analytical comparison of total saponins of Akebiae Fructus by different macroporous resins

静态解析试验：将上述静态吸附后的10 种树脂水洗后晾干，分别置100 mL 具塞锥形瓶中，分别加入80%乙醇溶液20 mL，密封，置摇床（转速为150 r/min）振荡12 h，使其充分解析，取一定量吸附后液体，按2.2 项下方法测定总皂苷吸光度，并计算不同型号大孔树脂对预知子总皂苷的解吸附率与解吸附效果，解吸附率（%）=C2CV/W×100%，解吸附效果（%）=解吸附率/吸附率×100%。式中，C2为解析浓度，CV为解析体积。详见表1。可见，S-8 型大孔树脂对预知子总皂苷的吸附率、解吸附率与解吸附效果均较其他树脂高，故选择S-8型树脂用于后续预知子总皂苷的分离与纯化。

2.5 上样条件考察

上样液pH：精密量取8 份5 mL 预处理过的S-8 型大孔树脂，加入pH 分别为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5 的预知子提取物溶液15 mL，置摇床（转速为150 r/min）振荡12 h，测定吸附前后溶液中总皂苷的含量。由图1 可知，pH 为2.5 时吸附率最高（52.72%），故最佳上样液pH 为2.5。这可能是因为皂苷类化合物中含有羧基，在酸性条件下较稳定。由于三萜皂苷中有连接糖链，pH 过低会导致其水解成苷元，故上样液pH 最终选择2.5。

图1 上样液pH对总皂苷吸附效果的影响Fig.1 Effect of pH of the sample solution on the adsorption effect of total saponins

吸附等温线：精密量取8 份预处理过的S - 8 型大孔树脂5 mL，置100 mL具塞锥形瓶中，分别加入质量浓度为100～800 mg/mL 的预知子提取物溶液，于0，25，50 ℃水浴摇床恒温振荡12 h，测定吸附前后溶液中总皂苷的含量，并计算平衡吸附量（Qe），Qe=（C0-Ce）V/W。式中，C0为初始总皂苷质量浓度，Ce为吸附平衡后预知子总皂苷浓度，V为溶液体积。由图2 可知，树脂平衡吸附量随提取物浓度的增大而增加，随温度的升高而降低，表明低温有助于树脂的吸附，故S-8型树脂对预知子的吸附属放热过程。

图2 S-8型大孔树脂对预知子提取物的吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherm of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

吸附等压线：精密量取预处理过的S-8 型大孔树脂5 mL，分别置100 mL具塞锥形瓶中，加入质量浓度为200 mg/mL预知子提取物溶液15 mL，25 ℃下水浴摇床（转速为150 r/min）恒温振荡，每10 min 取出1 个锥形瓶，至浓度基本不变时停止，测定总皂苷含量，并计算瞬时吸附量（Qt），Qt=（C0-Ct）V/W。式中，Ct为t时刻总皂苷浓度。由图3可知，0～40 min内吸附量随时间的增加而快速上升，40～120 min内吸附率逐渐减缓，120 min后逐渐趋于平衡，为避免浪费提取液，故选择静态吸附2.5 h后进行洗脱。

上样量：取预处理后的S-8 型树脂40 mL，湿法缓慢装入吸附柱中，以一定质量浓度的预知子提取物溶液上样，保持流速为1.0 mL/min，每20 mL 收集1份流出液，测定总皂苷质量浓度，绘制泄露曲线。当流出液中该成分质量浓度为上样液的1/10 时，认为达到泄露点。由图4可知，第5份流出液中总皂苷质量浓度急剧上升，并超过上样液的1/10，故确定最大上样量为80 mL，即上样量与树脂体积比为2∶1（V/V）。

图4 S-8型大孔树脂对预知子提取物的泄露曲线Fig.4 Leakage curve of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

2.6 洗脱条件考察

洗脱液体积分数：取预处理好的S-8 型大孔树脂20 mL，湿法装柱，取40 mL pH 为2.5 的预知子提取物溶液（质量浓度为200 mg/mL），以1 mL/min 的流速上样，动态吸附2.5 h 后用6 BV 体积蒸馏水除杂，依次用3 BV 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，于540 nm 波长处测定吸光度，计算总皂苷洗脱量。由图5 可知，3 BV 50%乙醇可洗脱大部分皂苷。综合考虑对预知子总皂苷的最大富集效果及节约溶剂，分别选用6，9，12 BV 体积的40%，50%，60%乙醇溶液进行响应面试验，选择最佳洗脱工艺。

图5 不同乙醇体积分数洗脱剂下总皂苷的洗脱量Fig.5 Elution amount of total saponins under different volume fractions of ethanol as eluents

Box - Behnken 响应面试验考察洗脱工艺：影响洗脱工艺的因素主要包括洗脱剂体积（因素A）、洗脱剂体积分数（因素B）、洗脱流速（因素C）。由于洗脱流速越大，洗脱剂与树脂作用时间越短，则需要更多的洗脱剂将物质洗脱下来，综合洗脱效果与生产效率，选择0.5，1.0，1.5 mL/min进行响应面试验。采用三因素三水平响应面法，取40 mL pH为2.5、生药质量浓度为200 mg/mL的预知子提取物溶液，以1.0 mL/ min 的流速上样，按2.2 项下方法测定总皂苷吸光度。响应面试验因素与水平见表2，试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。采用Design Expert 10.0.1 软件分析，以洗脱剂体积、洗脱剂体积分数、洗脱流速为响应变量，总皂苷回收率为响应值，进行回归拟合分析，得模型Y= 10.276 35A+6.845 28B+37.237 37C-0.103 21AB-0.820 19AC-0.059156BC-0.18725A2-0.049331B2-12.29081C2-191.552 93。由表4 可知，其中A，B，B2的影响极显著（P＜0.01），AB，C2的影响显著（P＜0.05）；由F值可知，各因素对总皂苷回收率的影响程度由大至小为洗脱剂体积分数＞洗脱剂体积＞洗脱流速。绘制各影响因素相互作用对预知子总皂苷回收率影响的三维响应面图，结果见图6。可知，响应面优化条件为，洗脱剂体积9.00 BV，洗脱剂体积分数59.80%、洗脱流速1.12 mL/min。考虑到试验的可操作性，决定采用9 BV 60%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为1.0 mL/min，进行验证试验。

表2 Box-Behnken响应面试验因素与水平Tab.2 Factors and levels of the Box-Behnken test

表3 Box-Behnken试验设计与结果Tab.3 Design and results of the Box-Behnken test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of the analysis of variance

图6 各因素相互作用对预知子总皂苷回收率影响的三维响应面图A.Volume of eluent-Volume fraction of eluent B.Volume of eluent-Flow rate of elutionC.Volume fraction of eluent-Flow rate of elutionFig.6 Three dimensional response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the recovery rate of total saponins from Akebiae Fructus

验证试验：精密量取S-8 型大孔树脂20 mL，加入pH 为2.5 的预知子提取物溶液40 mL，以1.0 mL/ min的流速上样，9 BV 60%乙醇洗脱（流速为1.0 mL/min），平行3 份。结果预知子总皂苷转移率分别为76.09%，76.64%，76.59%，平均为76.44%（RSD为0.40%），与预测值77.21%相差-0.77%，表明该工艺稳定、可靠。

2.7 预知子总皂苷体外抗氧化活性测定

DPPH 自由基清除能力测定：参考文献［18］，用95%乙醇溶液配制0.1 mmol/ L 的DPPH 溶液（临用现配）。吸取0.4 mL乙醇与0.2 mL DPPH 溶液，混匀，作为空白对照组（A0）；吸取0.4 mL 不同浓度总皂苷样品溶液与0.2 mL 无水乙醇，混匀，作为样品对照组（A1）；吸取0.4 mL不同浓度总皂苷样品溶液与0.2 mL DPPH 溶液，混匀，作为试验组（A2）。37 ℃避光孵育30 min，于517 nm 波长处测定吸光度。DPPH 自由基清除率（%）=［1-（A2-A1）/A0］×100%。结果表明，总皂苷样品溶液的质量浓度在0.03～1.67 mg/mL 范围内与DPPH 自由基清除率量效关系良好。得拟合方程Y= 0.003 5X-0.009 1（R2=0.994 6），半数抑制浓度（IC50）为0.15 mg/mL。

ABTS 自由基清除能力测定：参考文献［19］，吸取7mmol/LABTS溶液与4.9mmol/L 过硫酸钾溶液，按1∶1（V/V）混合，室温避光反应12～16 h，使用前用去离子水稀释，于734 nm波长处测定吸光度为0.70±0.02。吸取0.5 mL ABTS 溶液，加0.1 mL 去离子水，混匀，作为空白对照组（A0）；吸取0.5 mL ABTS 溶液与过硫酸钾溶液，混匀，加0.1 mL 不同浓度总皂苷溶液，作为试验组（A1）。室温避光反应20 min，于734 nm 波长处测定吸光度。ABTS 自由基清除率（%）=［（A0-A1）/A0］×100%。得拟合方程Y=0.318 5X+0.027 3（R2=0.998 8），IC50为1.54 mg/mL，表明总皂苷样品溶液质量浓度在0.33～2.67 mg/ mL 范围内与ABTS 自由基清除率量效关系良好。

总抗氧化能力检测：按总抗氧化能力检测试剂盒说明书操作，将硫酸亚铁标准溶液用蒸馏水稀释为不同梯度浓度，绘制标准曲线，得回归方程Y=4.421 8X+0.001 1（R2=0.999 3），表明硫酸亚铁浓度在0.001 56～0.05µmol/mL范围内线性关系良好。按7∶1∶1的比例将试剂1、试剂2、试剂3混合成混合液，吸取混合液0.9 mL，加0.12 mL 蒸馏水作为A空白，加0.3 mL 样品与0.12 mL蒸馏水作为A测定。按公式ΔA测定=A测定-A空白计算ΔA测定，由回归方程可知预知子提取物浓度，计算总抗氧化能力。总抗氧化能力（µmol/mL）=XV反总/V样。式中，X为样本浓度，V反总为反应总体积，V样为反应中样本体积。按药材量计算质量浓度为80 mg/mL 的预知子总皂苷的总抗氧化能力为4.86µmol/mL。

3 讨论

三萜皂苷为预知子中的主要成分，药理活性广泛。本研究中首次利用大孔树脂分离纯化预知子中的总皂苷，并通过考察10 种不同极性的大孔树脂对预知子总皂苷的吸附率及解吸附率，筛选出S-8 型大孔树脂用于分离纯化预知子总皂苷；通过单因素试验结合Box-Behnken 响应面试验确定了上样及洗脱工艺，确定了以上样液质量浓度为200 mg/ mL，上样液体积与树脂体积比为2∶1（V/V），pH 为2.5，以9 BV 60%乙醇溶液洗脱，流速为1.0 mL/ min 为条件进行分离纯化，且预测值和验证结果相符，表明该工艺稳定可靠。

预知子作为一种药食同源的中药，由于目前对其生物活性及药理作用机制尚不明确，导致其应用并不广泛。而DPPH 和ABTS 自由基清除及总抗氧化能力由于方法简单、快速、经济、可靠，被广泛应用于天然产物抗氧化活性的评价中［20］。本研究结果表明，预知子总皂苷具有一定抗氧化能力，可为功能性食品开发及后续有关预知子中三萜皂苷的研究提供参考。