接骨木镰刀菌产呕吐毒素条件筛选及致病性分析

肖萌萌,贺付蒙,冯 旭,徐永清,蒋先锋,王 雪,刘 丹,李凤兰

(东北农业大学 生命科学学院,哈尔滨 150030)

马铃薯(Solanumtuberosum)是人类的主要食物来源之一[1]。然而,马铃薯干腐病作为一种常见的贮藏病害,严重影响马铃薯的品质和市场价值[2]。据估计,约有6%～25%的马铃薯储藏期产量损失是由干腐病造成的[3-4]。镰刀菌是马铃薯干腐病的主要病原菌[5],闵凡祥等[6]和李凤兰等[7]鉴定了黑龙江省马铃薯干腐病主要病原菌有7个种及变种,分别为拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotriodides)、拟丝孢镰刀菌(F.trichothecioides)、茄腐镰刀菌(F.solani)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、茄腐镰刀菌蓝色变种(F.solanivar.coeruleum)和黄色镰刀菌(F.culmorum)。其中接骨木镰刀菌致病性最强,是甘肃、黑龙江、河北等马铃薯主产区的优势病原菌[8]。研究表明镰刀菌能产生次级代谢产物镰刀菌毒素,从而使植物致病。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名呕吐毒素,是马铃薯干腐病致病镰刀菌分泌的毒素之一,被认为是重要的致病因子[9]。

1972年,呕吐毒素在日本的赤霉病大麦中首次分离得到,并进行鉴定和命名[10]。其化学名称为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮,分子式为C15H20O6,在水和极性溶剂中溶解度良好[11]。呕吐毒素理化性质较稳定,在弱酸条件具有较强的耐受性,而在碱性条件下不稳定[12]。呕吐毒素作为一种霉菌毒素常见于动物饲料中,通过动物肠道进入机体产生毒理作用[13]。其产量受各种因素的影响,菌株是关键因素[14]。Bajestani等[15]通过研究小麦对真菌提取物、孢子悬液、呕吐毒素的防御反应,发现低浓度呕吐毒素能诱导小麦系统获得性抗性的产生,从而提高对疮痂病的抗性。研究表明低浓度呕吐毒素处理马铃薯提高了薯块防御酶和抗氧化酶的活性,从而有效提高了马铃薯的抗病性[16]。毒素能够在感病组织中或人工培养条件下获得[17]。通过对苦瓜枯萎病菌毒素[18]、玉米伏马毒素[19]和赭曲霉毒素A[20]产生条件的研究表明,人工培养条件下毒素产量与培养时间、环境等条件有关。目前对于呕吐毒素产生条件的研究较少。

为探讨呕吐毒素与马铃薯抗病诱导的相关性,首先需要培养出大量的呕吐毒素,然而对于接骨木镰刀菌产呕吐毒素的培养条件迄今未见报道。本研究以接骨木镰刀菌为研究对象,通过响应面法探究呕吐毒素产生条件,研究接骨木镰刀菌在产毒条件、毒素积累动态变化规律、霉变程度与呕吐毒素之间的关系,为窖藏马铃薯提供用于指导防控实践的理论依据,有望在最大程度上降低马铃薯干腐病的风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试致病镰刀菌为接骨木镰刀菌(F.sambucinum),供试植物为大西洋马铃薯,均由东北农业大学寒地药用植物资源实验室保存。呕吐毒素ELISA检测试剂盒(NO.HEM0896/HEM0848)由中国北京华安麦格纳奇生物科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 毒素粗提液制备 将置于25 ℃恒温培养箱中暗室培养的镰刀菌用研钵进行粉碎处理,然后转到锥形瓶中,取100 mL提取液[V(乙腈)∶V(水)=84∶16],充分搅拌后密封。用超声震荡法提取1 h,抽滤后收集滤液,转至旋转蒸发仪内65 ℃旋转蒸干,然后用色谱级纯甲醇4 mL溶解瓶壁残留物,以10 000 r/min离心5 min,取上清液为毒素粗提物,4 ℃保存,以备后续试验。

1.2.2 LC-MS分析 将毒素粗提液用注射器和0.45 μL滤膜进行过滤,然后装入棕色小瓶,再加入100 μL的0.1 mol/L冰醋酸促进电离,进行样品检测。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流速0.25 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL,流动相A为 0.05%甲酸和1 mmol/L乙酸铵水溶液,B为甲醇,梯度洗脱条件为0～11 min,20%～40%B; 11～16 min,40%～70%B;16～25 min,70～95%B;95%B冲洗10 min;每次进样前用20%B平衡柱子,10 min。

1.2.3 单因素试验及设计方案 分别考察碳源种类(乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)、培养时间 (10 d、15 d、20 d、25 d、30 d)、碳源浓度(10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L)、培养温度 (20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃)、pH(5.7、5.9、6.1、 6.3、6.5)等因素对呕吐毒素产量的影响,采用酶联免疫法测定呕吐毒素的含量,平行试验3次,结果取平均值,确定最佳产毒条件。

1.2.4 响应面设计 以单因素试验结果为基础,选择培养时间、温度和pH 3个因素,应用Design-Expert v8.0.6软件采用4因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计法,每个因子设置为高、中、低3个水平(-1,0,1)作出响应曲面图。

1.2.5 毒素在致病性中的作用 方法参照单玮玉等[21]略有改进,将大西洋马铃薯消毒后,用打孔器打出直径为1 cm深1.5 cm的孔,以水为对照,以300 μL浓度为10 ng/mL的呕吐毒素为处理组,经6 h后将培养好的接骨木镰刀菌挑取菌丝并接种在马铃薯体内,在25 ℃恒温培养箱暗室中培养10 d后调查发病率和病情指数。试验设3次重复,每次重复选5个块茎,根据病斑面积占薯块表面积的百分比分为5级,标准为:0级块茎无病斑,1级病斑面积为5%以下,2级病斑面积为6%～15%,3级病斑面积为16%～30%,4级病斑面积为31%～50%,5级病斑面积为50%以上。病情指数=Σ(各级发病块茎×相对级数值)/(总块茎数×最高病情级数)×100。

1.2.6 数据处理 采用Microsoft office Excel 2007和SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 镰刀菌的毒素分析

用LC-MS检测样品发现(图1),呕吐毒素标准品的保留时间在样品里也有峰,且呕吐毒素的含量为6.10 ng/mL(表1)。

表1 LC-MS检测呕吐毒素标准品和样品的呕吐毒素含量Table 1 Vomitoxin content of vomitoxin standards and sample tested by LC-MS

A.为标准品;B.为检测样品

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碳源种类 由图2-A可知,接骨木镰刀菌在不同的碳源培养基上都能产生呕吐毒素,但产毒量有显著差异。在以葡萄糖为碳源时,镰刀菌产呕吐毒素量最高,达到1.38 ng/mL;以乳糖为碳源时,呕吐毒素产量最低为0.57 ng/mL,因此选择葡萄糖作为碳源。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.2 培养时间 由图2-B可以看出,培养前期呕吐毒素产量变化较为平缓,随着培养时间的延长,在20～25 d产毒速率明显加快,产毒量最高为2.25 ng/mL,并在25 d后产毒量出现下降趋势,说明培养时间影响镰刀菌产呕吐毒素的能力。因此将25 d作为最优条件继续培养,并将响应面试验的培养时间设置为20～30 d。

2.2.3 培养温度 图2-C显示,当培养温度由20 ℃上升到25 ℃时,随着温度的升高,接骨木镰刀菌产生的呕吐毒素浓度逐渐升高,并且在23 ℃至25 ℃过程中产毒速率加快,当培养温度继续升高,毒素含量逐渐降低,产毒量趋于平缓,说明温度过高或过低都不利于接骨木镰刀菌产毒,可能是因为温度会影响酶活。在培养温度为25 ℃时,达到最高产毒量1.85 ng/mL,因此将响应面优化试验的培养温度设置为23～27 ℃。

2.2.4 pH 由图2-D可见,随着pH由酸性到弱碱性过程中,呕吐毒素含量呈现先升高后降低趋势,具体表现为pH 为5.9～6.1的条件下毒素含量迅速升高,然后逐渐降低,故确定以pH 5.9、6.1和6.3进行响应面优化分析。

2.2.5 碳源浓度 检测碳源不同添加量对呕吐毒素的产生情况,如图2-E所示,随着碳源浓度持续上升,呕吐毒素产量趋于平缓,表明碳源浓度对接骨木镰刀菌产呕吐毒素的能力影响不大。

2.3 接骨木镰刀菌产呕吐毒素条件优化

2.3.1 响应面试验结果与回归方程的建立 选择A(培养时间)、B(培养温度)、C(pH),根据呕吐毒素含(Y)的响应值,考察3个因素对镰刀菌产呕吐毒素的影响(表2),进行3因素3水平产毒条件响应面优化。结果如表3所示,分析得到呕吐毒素含量(Y)对编码变量A、B、C的二次多项回归方程为:Y=2.42+0.35A+0.16B+ 0.063C-0.050AB+0.15AC+0.020BC- 0.77A2-0.10B2-0.55C2。

表2 响应面试验因素水平Table 2 Response surface test factor level

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and result

由方差分析可知(表4),该响应面模型具有显著性,回归极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P=0.461 7)。R2为0.995 2,Radj=0.989 1,表明预测值与实际值有较高的相关性,拟合良好。因素一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2的P值均小于0.05,表明它们对镰刀菌产呕吐毒素有较大影响,交互项只有AC对呕吐毒素产量有显著影响(P<0.05)。进一步说明该方程与实际结果拟合较好,可靠性高。可用于呕吐毒素含量的分析与计算;从各项F值可以看出,呕吐毒素含量关键因素的关系为:A>B>C,即培养时间> 培养温度>pH。

表4 响应面法方差分析Table 4 Response surface analysis of variance table

2.3.2 响应面模型分析 根据回归方程得到呕吐毒素含量与培养时间、培养温度和pH 3个因素的3D响应面模型(图3),均为开口向下的凸形曲面,表明在考察范围内存在响应值的极大值,由图3-A可知培养时间对呕吐毒素含量的影响较大,随着培养时间和培养温度逐渐增加,呕吐毒素含量呈先升高后降低的趋势。在培养时间24～28 d,培养温度24～27 ℃时,呕吐毒素含量处于较高水平。在固定培养温度的情况下,如图3-B所示,培养时间与pH反映出一定的交互作用,随着培养时间的延长及pH增大,呕吐毒素含量呈先升高后降低的趋势,呕吐毒素含量最大值出现在培养时间24～29 d,pH 6.0～ 6.3时。由图3-C可知,在固定培养时间的条件下,呕吐毒素产量随培养温度及pH升高呈现先升高后降低的趋势,在pH为6.0～6.3,培养温度24～27 ℃时,呕吐毒素含量在较高范围内。综上所述,呕吐毒素含量的最大值出现的条件为:培养时间24～28 d,培养温度24～27 ℃,pH 6.0～6.3。

A.培养温度和培养时间;B.培养时间和pH;C.培养温度和pH

2.3.3 优化工艺验证 由Design-Expert V8.06软件求解回归方程,得出呕吐毒素含量最大时的条件为:以葡萄糖为碳源,培养温度26.19 ℃、pH 6.12、培养时间25.38 d。在此条件下,呕吐毒素含量预测值为2.50 ng/mL。综合试验操作的可行性,调整产毒条件为:培养温度26 ℃、pH 6.1、培养时间25 d,进行3次重复试验,呕吐毒素含量为2.57 ng/mL,与预测值相差不大,说明此条件可以有效提高接骨木镰刀菌产呕吐毒素含量。

2.4 毒素在致病性中的作用

由图4和表5可知,用水(A)处理的马铃薯病健交界区域宽,呈现浅褐色,病健交界线不明显且有蔓延趋势,病情指数为61.3。而用呕吐毒素(B)处理马铃薯,病斑平均直径均小于水处理,病情指数为41.3。薯内病健交界区域极窄且呈现深褐色,病健交界线更为清晰明显,呕吐毒素处理的块茎病斑明显小于水处理,且呕吐毒素处理后病斑几乎无蔓延。

表5 毒素致病性分析Table 5 Pathogenicity analysis of toxins

A.水+镰刀菌处理;B.DON+镰刀菌处理

3 讨 论

镰刀菌毒素的产生受到许多因素影响,如温度、pH和时间等[22-23]。研究表明小麦贮藏阶段的呕吐毒素在温度为25～30 ℃时大量积累[24]。唐亚梅等[25]利用响应面分析法对硫色镰刀菌体外产毒条件进行筛选,结果表明温度 22.2 ℃及pH 5.1最有利于产毒,镰刀菌会随着温度的升高而快速生长,但产毒能力也会受到抑制[22]。本研究也出现类似趋势,在25 ℃产毒量最高,温度过高会造成酶失活,不利于镰刀菌产毒。李俊霞等[26]在对四川玉米串珠镰刀菌进行研究时发现其最佳产毒pH为5。本研究发现酸性条件有利于镰刀菌产毒,研究结果与Merhej等[27]的研究类似。闫海霞[28]研究表明:禾谷镰刀菌中呕吐毒素的产量与时间呈近似抛物线关系且在30 d时产毒最高。而本研究中接骨木镰刀菌在25 d产毒量达到高峰,这可能是由于菌株不同而造成的差异。

呕吐毒素可以引起植物的代谢物转化、氧化应激反应等一系列寄主防御反应[29]。低浓度呕吐毒素作为激发子处理马铃薯,提高了几丁质酶活性以及木质素、花青素的积累[16]。从镰刀菌毒素与致病性的试验结果来看,毒素处理的马铃薯病健交界区域极窄,无蔓延趋势,说明低浓度呕吐毒素诱导了马铃薯的防御反应,合成木质素以及酚类等物质,病健交界处呈现深褐色,阻止了病斑进一步蔓延。镰刀菌及毒素与马铃薯的互作是极其复杂的过程,包括镰刀菌产生的代谢产物以及马铃薯防御反应产生的酶及其他抗性物质,呕吐毒素对马铃薯的这种抗性诱导是否会在分子水平对马铃薯块茎具有影响需要进行更多的研究和 分析。