激光散射法测定那他霉素粒度研究

孙 超,康 帅,王冬燕,高福然,程启东

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司,河北石家庄 052165; 2.微生物药物国家工程研究中心,河北石家庄 052165; 3.河北省工业微生物代谢技术创新中心,河北石家庄 052165; 4.华北制药华胜有限公司,河北石家庄 052160)

那他霉素(natamycin)又名匹马菌素或游霉素,为白色或淡黄色结晶性粉末,是由纳塔尔链霉菌经发酵得到的一种大环内酯类抗菌剂,在体外它具有抗多种丝状真菌(如念珠菌、青霉菌和镰刀霉菌等)和酵母菌的作用[1-2]。那他霉素分子的疏水部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子相结合,形成多烯固醇复合物,破坏细胞质膜的渗透性,引起真菌内氨基酸及电解质等重要物质的渗出,从而达到灭杀真菌细胞的作用[3-4]。那他霉素滴眼液是治疗真菌性角膜炎和角膜溃疡最常用药物之一,且因其良好的治疗效用,成为大多数眼病患者的首选药物。

由于那他霉素为难溶性药物,在制剂中以固体微粒的形式存在。因此,原料药的粒度大小对其制剂产品质量和疗效影响较大。不同粒度原料药制备的制剂,在体内的吸收、分布和治疗效果不同。若因粒度大小及分布不均使得疗效不稳定,引发不良反应增加,可能会导致使用安全问题[5-7]。因此,对那他霉素原料药粒度进行测定和控制是很有必要的。

在原料药和药物制剂的质量标准中,粒度分布已经成为一个较为重要的检测项目。粒度分布的测定方法有筛分法、沉降法、显微镜法和激光散射法等[8],其中激光散射法因具有快速、方便和样品用量小等优点,成为一种常用的粒度分布测定方法。激光散射法是依据米氏理论和弗朗霍夫散射理论,通过测量散射光强度完成粒度测定,被广泛应用于原料药粒度大小和分布的质量控制[8-10]。吴燕等[11]与沈丹丹等[12]对激光散射法与显微镜法进行了对比研究,2种测定方法结果没有显著差异,但显微镜法测定速度慢,样品量少,代表性不强,只适合粒度分布范围较窄的样品。张洪英等[13]采用新帕泰克激光粒度仪建立了一种干法测定盐酸莫西沙星原料药粒度的方法,并对此方法进行了验证,但验证内容仅包括重复性,没有考察随机变动因素(如日期、分析人员、仪器)及测定参数微小变化对测定结果的影响。邓银来等[14]采用Mastersizer 2000激光粒度仪建立了湿法测定替格瑞洛原料药粒度的方法,并对该方法进行了验证,验证内容仅包括重复性和中间精密度试验,也没有考察测定参数微小变化对测定结果的影响。

笔者参照2020年版《中华人民共和国药典》(四部)[15](以下简称《中国药典》)及Mastersizer 2000激光粒度仪说明书,对激光散射法测定那他霉素粒度的关键参数进行了优选,开发了一种那他霉素粒度的测定方法。并依照人用药品技术要求国际协调理事会(ICH)关于分析方法验证(以下简称:ICH Q2(R1))指南、现行《中国药典》和《美国药典》第429章关于粒度光衍射测量(以下简称:USP〈429〉)指导原则[16],在重复性和中间精密度试验的基础上增加了耐用性试验,使验证内容更加科学严谨。

1 实验条件与测定方法

1.1 仪器与试剂

Mastersizer 2000激光粒度仪,由马尔文帕纳科公司提供;T-1000型电子天平,由常熟双杰测试仪器厂提供;那他霉素原料药(批号:YFNT220201,YFNT220202,YFNT220203),由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 测定方法

首先,称取0.5 g样品置于瓶中(或袋中),轻摇使样品混合均匀。然后,将样品置于干法进样器的进样盘中,关闭进样器盖子,采用Mastersizer 2000激光粒度仪干法测定、通用模型分析模式、标准文丘里管进行测定,测定参数:分散气压为0.30 MPa,振动进样速度为45%,背景和测量扫描时间为10 s,样品折射率为1.50,颗粒吸收率为0.1,遮光度范围为0.5%～5%,每个试样重复测定2次。

2 测定参数的选择

2.1 分散气压的选择

对于粒度较小的颗粒,其分散状态是决定测定结果是否准确的关键因素,分散气压过小,样品颗粒容易聚集,分散气压过大,样品颗粒则会被分散气流吹碎导致测定结果偏小[17]。本研究将振动进样速度设为45%,测量时间设为10 s,分散气压分别设置0.20,0.25,0.30,0.35和0.40 MPa,测定那他霉素的粒度,结果见表1。

表1 不同分散气压下的粒度测定结果

由表1可知,随着分散气压的增大,粒度的测定结果呈减小趋势,分散气压为 0.25～0.35 MPa时,平均残差均小于1%。分散气压为0.30 MPa时,平均残差最小,表明在该分散气压下,颗粒分散效果最好,因此选择分散气压为0.30 MPa。

2.2 进样速度的选择

通过激光散射法测定粒度时,样品通过振动盘进入系统,振动进样速度过快,遮光度太高,易发生多重衍射,进样速度过慢则样品的流动会出现中断,影响测定的准确度。本研究将分散气压设为0.30 MPa,测量时间设为10 s,振动进样速度分别设置为40%,45%和50%,测定那他霉素的粒度,结果见表2。

表2 不同振动进样速度下的粒度测定结果

由表2可知,当设定分散气压为0.30 MPa,进样速度为40%～50%时,粒度的测定结果平均残差均小于1%,进样速度为45%时,平均残差最小,因此选择振动进样速度为45%。

2.3 测量时间的选择

将分散气压设为0.30 MPa,振动进样速度设为45%,测量时间分别设置为5,10和15 s,测定那他霉素的粒度,结果见表3。

表3 不同测量时间的粒度测定结果

由表3可知,当设定分散气压为0.30 MPa,振动进样速度为45%,测量时间分别为5,10和15 s时,平均残差均小于1%,粒度测定结果基本一致,测量时间为5 s时,样品用量小于0.2 g,测定结果代表性差,综合考虑,选择测量时间为10 s。

3 方法验证

3.1 重复性试验

按“1.2”项下的测定参数,测定那他霉素原料药的粒度,连续测定6次,统计6次D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的均值及相对标准偏差(RSD),结果见表4。

表4 重复性试验结果(n=6)

由表4可知,6组数据的D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分别为2.2%,5.4%和2.3%,说明该方法重复性良好。

3.2 中间精密度试验

按“1.2”项下的测定参数,由2名试验人员分别进行那他霉素原料药粒度的测定,连续测定6次,与表4的6组数据一起计算RSD,结果见表5。

表5 中间精密度试验结果

由表5可知,试验人员1测定后D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分别为2.1%,5.4%和2.3%,试验人员2测定后D(0.1)、D(0.5)、D(0.9)的RSD分别为1.8%,1.5%和0.7%,说明该方法中间精密度良好。

3.3 耐用性试验

分别考察分散气压((0.30±0.03)MPa)、振动进样速度(45%±5%)发生微小变化对那他霉素原料药粒度测定结果的影响。

1)在测定分散气压0.30 MPa基础上,调整分散气压为0.27 MPa和0.33 MPa,按照“1.2”项描述的方法分别测定3次,与表4前3组数据一起计算RSD,结果见表6。

表6 耐用性(分散气压)试验结果

由表6可知,当分散气压为(0.30±0.03) MPa时,D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD分别为2.4%,5.1%和3.4%,该方法耐用性良好。

2)在振动进样速度45%基础上,调整进样速度分别为40%和50%,按照“1.2”项描述的方法分别测定3次,与表4前3组数据一起计算RSD,结果见表7。

表7 耐用性(振动进样速度)试验结果

由表7可知,当振动进样速度为45%±5%时,D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD分别为1.6%,4.9%和3.0%,该方法耐用性良好。

4 样品测定与讨论

4.1 样品测定

按“1.2”项下仪器参数测定3批那他霉素原料药粒度分布,统计各批次样品的D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的平均值及RSD,各批次原料药粒度分布测定结果的RSD均符合要求,结果详见表8。

表8 原料药的粒度测定结果

4.2 讨 论

激光粒度仪测定方式有湿法和干法2种。采用湿法测定样品粒度分布,方法开发过程繁琐,需要考察分散介质的种类、超声时间、搅拌速度、表面活性剂的种类与浓度等对测定结果的影响,并且湿法测定时间长、样品池不易清洗,同时使用有机分散剂会污染环境。本研究根据那他霉素的理化性质,选择干法方式测定粒度分布,操作简单、准确度高,并且对主要测定条件包含分散气压、振动进样速度和测量时间等进行了优选。在光学参数设置方面,因干法测定的分散介质为空气,空气的折射率为1.00,因此本方法中折射率选择仪器默认值1.50。吸收率在0到1之间,其中浅色粉末为0.1,故本方法选择吸收率为0.1。按照《中国药典》附录要求,控制检测器遮光度范围为0.5%～5%。

USP〈429〉指导原则要求,激光散射法测定粒度分布的中心值D(0.5)的RSD应小于10%,D(0.1)和D(0.9)的RSD均应小于15%,当D(0.5)小于10 μm时,粒度分布特征值的RSD限度可放宽1倍。本研究依据USP〈429〉指导原则要求,将方法学考察结果和样品测定结果的RSD标准适当收窄,设定各项考察结果RSD为小于10%。

ICH Q2(R1)指南和《中国药典》分析方法验证指导原则[15]规定,典型的验证项目包括:线性、范围、专属性、精密度、准确度、耐用性、检测限、定量限等。但粒度测定仪器不能对样品中的不同组分进行区分,所以线性、专属性、准确度、检测限、定量限不适用于粒度测定方法的验证。USP〈429〉指导原则中,激光散射法测定粒度的验证项目包括重复性和中间精密度。本研究根据马尔文帕纳科公司培训资料,在USP〈429〉指导原则基础上,进行了重复性、中间精密度和耐用性的验证试验,使激光散射法测定粒度方法的验证内容更加科学严谨。

5 结 语

本研究基于那他霉素粒度分布测定的质量需求,使用Mastersizer 2000激光粒度仪,建立了激光散射法测定那他霉素粒度的方法,并对所开发的方法进行了方法学验证,所得结论如下。

1)该方法在重复性、中间精密度的基础上增加了耐用性试验,各项验证指标相对标准偏差均符合要求。

2)按照所确定方法连续进行了3批样品的测定,其D(0.1)、D(0.5)和D(0.9)的RSD均小于2.5%,表明该方法的准确度及稳定性良好,可用于那他霉素原料药的粒度测定和生产中的粒度质量控制。

本研究建立的激光散射法测定那他霉素粒度方法操作简单、精密度高、重复性好,能够有效控制原料药的批间差异,可为生产出安全、有效、均一、稳定的制剂产品提供保障。

本研究尚未对原料粒度与制剂疗效进行相关性分析,下一步的研究工作可通过继续研究粒度与制剂产品疗效的关系,来精准控制那他霉素原料药的粒度,进一步提高其制剂工艺和制剂产品的稳定性。