我国水稻白叶枯病和条斑病发生与防控研究进展

徐夏萌, 沈丽丽, 闫佳丽, 王 勇, 徐正银, 陈功友*

(1. 上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2. 光明食品集团上海川东农场有限公司种植业中心，盐城 224133)

水稻是中国第一大粮食作物,其产量占中国粮食产量的40%左右。由稻黄单胞菌稻致病变种Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起的水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻三大病害(稻瘟病、白叶枯病和稻纹枯病)之一,由稻黄单胞菌稻生致病变种Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)引起的水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)已发展成为水稻的第四大病害。水稻细菌性条斑病应简称为条斑病,不应简称为细条病,因为我国植物病害的名称是根据病害症状特点而命名的,即因受平行叶脉限制而形成的条形病斑是条斑病的典型特点。白叶枯病“老病重发”,条斑病“新病暴发”和两种病害混合发生,成为我国南方水稻产区重要致灾病害。常发年份水稻减产10%～30%,暴发年份减产50%以上。据统计,我国两种致灾病害重发年份发生面积200万hm2左右,严重威胁我国粮食安全生产[1]。我国水稻受白叶枯病和条斑病危害的主要原因在于病害的绿色防控依然存在3个短板。1)病害成灾机制不清楚:对我国水稻产区两种病菌毒性组成的分子基础不清楚,无法有效监控预警,也不能针对性地布局抗病品种;2)精准抗病育种新技术匮乏:现利用的抗病基因正不断地被病菌克服抗性,缺乏科学预见和新的抗病育种技术;3)绿色农药和防控技术短缺:田间病害发生时防控方法老套,缺乏绿色防控农药。

1 两种水稻细菌病害的差异

目前已经鉴定的白叶枯病抗病基因(R)约47个[1-2],而这些R基因绝大多数不抗条斑病;相应地,抗条斑病的R基因不抗白叶枯病。这主要与两种水稻细菌病害的发生特点和病菌致病因子的差异有关。白叶枯病是系统性维管束侵染病害,而条斑病是局部性薄壁细胞侵染病害[3]。Xoo和Xoc虽均为稻黄单胞菌X.oryzae,但是两个不同的致病变种(pathovar)。除都能通过伤口侵染水稻外,Xoo还能通过水孔侵染水稻,在维管束中繁殖扩展危害,造成白叶枯病害症状;而Xoc则还能通过气孔侵染,在薄壁细胞间繁殖扩展危害,受平行叶脉的限制,造成水浸状长条形病害症状。Xoo和Xoc的侵染途径和引起的病害症状差异可能与它们从水稻上获得营养的方式有关,例如Xoo主要获取蔗糖等[4-6],而Xoc主要获取硫化物等[7]。

2 稻黄单胞菌tal基因是毒性变异的主要决定因子

因稻黄单胞菌所致水稻细菌病害在生产上的重要性,其被认为是模式植物水稻上的模式病原菌[3]。稻黄单胞菌组学和致病因子揭示,Xoo和Xoc存在类似的致病性因子,例如相似的分泌系统[8]、群体感应系统[9]、第二信使c-di-GMP[10]等,而在效应蛋白上存在差异,例如Xoc缺少与抗病基因Xa21对应的PAMP分子RaxX[11],Xoo缺少蛋白水解酶活性[12]、缺少匹配抗病基因Rxo1的Ⅲ型效应子AvrRxo1[13]以及缺少与水稻气孔免疫互作的Xop蛋白XopC2[14]和XopAP[15]。重要的是,它们均拥有数量比较多的tal(transcription activator-like)基因编码的TALE(TAL effector)蛋白[16-17]。稻黄单胞菌产生的TALE蛋白,借助Ⅲ 型分泌系统分泌进入水稻细胞核与水稻中相应的R或S基因启动子的特定DNA序列结合(TAL effector-binding element, 简称EBE),起转录因子作用,激活R或S基因表达,从而水稻表现抗病性或感病性[16-17]。稻黄单胞菌 TALE蛋白高度保守,N-端和C-端几乎相同,不同的是由34个氨基酸构成的重复单元数量不同,每个重复单元的第12和13位氨基酸种类可变(repeat-variable diresidues,RVDs);这2个位点的氨基酸可识别1个碱基;RVDs的种类和数量不同,TALE识别水稻中相应基因启动子中的EBE序列不同[18-19]。虽然根据TALE蛋白的RVD可以预测其结合的EBE序列,从而发现TALE蛋白作用的植物靶标基因[20],但至今稻黄单胞菌的许多TALE蛋白在水稻中的靶标基因并不清楚,还需要通过生物学试验进行发掘。

遗传学分析发现,稻黄单胞菌的TALE蛋白存在2种类型[21-22](图1)。一类为典型结构的TALE蛋白(typical TALE,tTALE),TALE蛋白间的差异性主要在中央重复区(CRR)的重复单元数量上,例如Xoo菲律宾6号小种PXO99A的TALE蛋白PthXo1的CRR中重复单元数量为23.5个[6]。已知作用于水稻靶标基因的TALE蛋白其CRR中重复单元的数量不同(表1),最少的重复单元仅有1.5个[12]。一般认为,重复单元在8个以上才能保证TALE蛋白发挥正常的功能[12]。另一类为截短类型的干扰性TALE蛋白(interfering TALE,iTALE),与tTALE相比,iTALE蛋白N-端缺失58个氨基酸,C-端缺失部分核定位信号和酸性转录激活域[22]。

表1 稻黄单胞菌TALE蛋白与水稻R/S基因对应关系Table 1 Rice R/S genes targeted by TALEs of Xanthomonas oryzae

图1 稻黄单胞菌TALE蛋白类型Fig.1 TALE proteins of Xanthomonas oryzae

稻黄单胞菌tal基因的发现以及TALE蛋白在病害中的作用,揭示了稻黄单胞菌tal基因是病菌毒性变异的主要决定因子。

3 稻黄单胞菌TALE蛋白调控水稻的抗(感)病性

现有证据表明,稻黄单胞菌TALE蛋白通过结合水稻中靶标基因启动子的EBE序列,激活靶标基因表达。根据TALE蛋白在水稻中的靶标基因功能,TALE蛋白有以下4种功能:

3.1 主要毒性因子(major virulence factor),靶向水稻感病基因

目前发现,非洲Xoo菌株含有7～8个tal基因,而亚洲菌株多达18个左右。因白叶枯病菌主要从水稻中获得蔗糖和果糖等营养,病菌TALE蛋白作用于水稻糖转运蛋白编码基因的启动子上,利于病菌获得营养。水稻糖转运蛋白编码基因主要是Clade Ⅲ家族的OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14,分别被白叶枯病菌的PthXo1、PthXo2和PthXo3激活[5-6, 23],并且人工合成的TALE蛋白也可以激活OsSWEET12和OsSWEET15基因的表达[4](表1)。PthXo1仅在菲律宾6号小种PXO99A中发现;而靶向OsSWEET13的PthXo2有5个变异的版本,相应地,水稻中被PthXo2识别的EBE存在10个类型[24];靶向OsSWEET14的TALE蛋白,在亚洲菌株中为PthXo3和AvrXa7[25]。非洲栽培水稻的历史不长,非洲菌株的TalF和TalC也可靶向OsSWEET14,但其结合的EBE不同于PthXo3[4, 26]。对OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14基因的启动子中被TALE蛋白识别的EBE同时进行基因编辑,所创制的水稻材料广谱抗水稻白叶枯病[24-25]。

白叶枯病菌的TALE蛋白还靶向水稻转录因子,例如PthXo7靶向OsTFIIAγ1[27],PthXo6和TalBMAI1靶向OsTFX1[27],TalBMAI1靶向OsERF#123[28](表1)。需要强调的是,虽然这些转录因子是感病基因,但它们被TALE蛋白激活后转录调控的下游基因并不清楚。

水稻条斑病菌的tal基因数量多达24～33个[16, 29]。可能条斑病菌对营养的需求不同于白叶枯病菌,靶向水稻感病基因的TALE蛋白目前已知的有2个:一是Tal2g和Tal5d,都靶向硫化物转运蛋白编码基因OsSULRT3;6[7, 30];另一是Tal2b和Tal2c,靶向2-酮戊二酸依赖型氧化酶基因OsF3H03g和OsF3H04g[31-32]。通过基因编辑技术突变OsSULRT3;6和OsF3H03g基因启动子的EBE位点,均提高了水稻对条斑病的抗性[30-31, 33]。目前还没有发现诱捕水稻条斑病菌TALE蛋白的R基因,不过有意思的是在非寄主烟草中存在诱捕AvrXa10的R基因[34],提示可在水稻远缘种或非寄主植物中发掘抗条斑病的R基因,以期解决水稻中无抗条斑病抗源问题。

3.2 无毒因子(avirulence factor),激活执行者(executor)基因

稻黄单胞菌除条斑病菌的Xop蛋白AvrRxo1被来自玉米的Rxo1识别[35],以及XopQ被本氏烟Nicotianabenthamiana中的ROQ1 [TNL,a nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein with a Toll-like interleukin-1 receptor (TIR) domain]识别[36]外,还没有发现其他可识别Xop蛋白的R基因。白叶枯病菌抗病基因启动子中的EBE可作为TALE蛋白的陷阱,如果TALE被捕捉,则该TALE蛋白为无毒因子。这种R基因产物也称为执行者(executor)(表1),定位于植物细胞的内质网上。这种“基因对基因”关系的“抗病基因-无毒因子”包括:Xa7-AvrXa7[37-38]、Xa10-AvrXa10[39]、Xa23-AvrXa23[40]和Xa27-AvrXa27[41]。非常有意思的是,这些R基因介导的抗性对条斑病并不起作用[42]。目前认为,Xa7和Xa23抗谱较广,在水稻育种中已被普遍使用[1]。不过研究发现,Xa7和Xa23抗性可被少数白叶枯病菌克服,应当在生产上结合病菌tal基因型检测,合理利用Xa7和Xa23抗性[1,43]。

3.3 逃逸子(decoy),逃逸NLR类抗病性

水稻Xa1抗病基因是水稻上第一个被克隆的NLR类R基因[46],约20年后人们才发现稻黄单胞菌多种典型结构的tTALE蛋白均可激活Xa1使水稻表现出抗性,而iTALE可抑制其抗性[21-22]。后来陆续发现了Xa1的等位基因Xa2、Xa14、Xa45(t)、Xo1等NLR类R基因,它们的差异主要在93个氨基酸组成的LRR单元的重复数不同[47-48]。iTALE的发现揭示了白叶枯病菌和条斑病菌利用iTALE逃逸Xa1抗性的原因,并且iTALE在95%以上的病菌群体中存在[22, 48]。更为重要的是,不同于胞质内的NLRs,Xa1等NLR类蛋白定位在植物细胞核,并且tTALE激活Xa1不依赖于TALE与EBE的结合。揭示细胞核中NLR类抗性机制,有助于利用Xa1类R基因培育抗两种细菌病害的水稻新品种。

3.4 转录因子(transcription factor),与水稻基础转录因子γ亚基形成转录复合体

稻黄单胞菌TALE蛋白识别水稻R或S基因启动子中的EBE,转录调控R或S基因的表达,前提是TALE蛋白需要与水稻基础转录因子γ5亚基(OsTFIIAγ5)形成转录复合体,才能保证R或S基因精准转录[45, 49-50]。OsTFIIAγ5也称为Xa5,当其39位氨基酸由缬氨酸变成为谷氨酸时(xa5),既抗白叶枯病[51],又抗条斑病[16],原因在于TALE蛋白不能与xa5结合形成转录复合体[45, 49]。当水稻中存在xa5时,含有PthXo7的白叶枯病菌仍能导致病害发生,原因在于PthXo7诱导了OsTFIIAγ1的表达,弥补了xa5的缺陷[49]。因此,含有xa5抗病基因的水稻,例如‘IRBB5’‘白香占’‘白丝占’和‘白粳占’,可抗白叶枯病和条斑病两种水稻细菌病害[1,52]。

4 用于水稻白叶枯病和条斑病防控的杀菌剂

我国使用农用链霉素、叶枯唑、噻枯唑、噻菌铜、壬菌铜等农药防治水稻白叶枯病和条斑病已近30年,病原菌已产生了抗药性[53]。随后噻唑锌问世,并在此基础上组合5%春雷霉素和35%噻唑锌研发的40%春雷·噻唑锌悬浮剂,解决了水稻细菌和真菌病害兼治问题[54-55]。同时利用生物农药防控水稻白叶枯病和条斑病的研究也取得突破性进展,解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensLx-11已被登记生产和使用[56]。最近报道,从水稻稻桩上分离的摩氏假单胞菌Pseudomonasmosselii923菌株,产生一种新型的小分子化合物咪唑三嗪(pseudoiodinine),对水稻稻瘟病、白叶枯病和条斑病均显示了较好的生物防治效果,有望发展为绿色农药[57]。

5 水稻白叶枯病和条斑病绿色防控策略

根据稻黄单胞菌tal基因型与水稻抗病基因型的对应关系[1]以及与感病基因型的对应关系(表1),我国白叶枯病和条斑病的防控,应遵循以下三种防控模式(图2)。模式1:白叶枯病发生区,种植Xa7或Xa23抗病水稻品种。模式2:条斑病发生区或两种细菌病害混合发生区,种植xa5高抗水稻品种。经过多年多点实践,模式1和2对水稻两种细菌病害的防控效果达94%以上,无需使用农药,或在病害零星发生时安慰性使用1次药剂(Lx-11解淀粉芽胞杆菌悬浮剂或40%春雷·噻唑锌悬浮剂)进行防控。模式3:无xa5、Xa7和Xa23抗病水稻品种种植区,两种细菌病害发病初期使用40%春雷·噻唑锌悬浮剂或Lx-11解淀粉芽胞杆菌悬浮剂1次,灭点保片;多雨季节,两种农药交替使用1～2次,防病效果也可达70%以上。

图2 绿色防控水稻白叶枯病和条斑病模式Fig.2 Green control strategies for bacterial leaf blight and bacterial leaf streak in rice