以外泌体为药物递送载体的研究进展

杨艳萍,陈加伟,林联君,张姗姗

(陕西服装工程学院 健康学院,西安 712046)

外泌体是内涵体来源,经由多泡体(MVBs)与质膜融合以后释放到细胞外的膜性囊泡状小体,内部分布着多种生物学大分子,有蛋白质、核酸和磷脂等,具有丰富的生物学功能,可作为细胞间物质和信号通信的重要途径。目前已知的多种疾病发展过程中,外泌体在参与机体的多种生理和病理发展过程中发挥着相应的作用,均可见其踪影[1]。外泌体载体综合了细胞药物递送与纳米技术的优势,作为一种具有天然特性的新型药物递送载体,拥有可以穿过机体生物屏障的特性,因此利用外泌体作为载体能将药物有效且安全地递送至人体机体各大系统,从而成为疾病治疗中一种可行的有效途径且前景极佳。

1 外泌体的结构组成及其功能特征

外泌体是由机体细胞分泌的一种具有生物膜特性的细胞外囊泡结构,粒径30～150 nm,机体相关的细胞均可以分泌对应的细胞类型外泌体,直径在30～150 nm的细胞外囊泡具有磷脂双分子层结构,能携带蛋白质、核酸(例如miRNA、lncRNA等)、脂质等多种重要的生物信息。由细胞膜组成的胞外小泡(如外泌体)可通过一系列表面黏附蛋白和载体配体(四肽、整合素、CD11b和CD18受体)附着到靶细胞上,并将其有效载荷传递给靶细胞。一些研究表明[2],胞外小泡,如外泌体,根据其特性和来源具有特定的细胞向性,可用于靶向疾病组织或器官。外泌体的形成过程包括细胞膜内陷,形成内吞小体,多个内吞小体融合为早期核内体,而早期核内体再次内陷,形成多泡体,多泡体与细胞膜嵌套融合,最后将形成的外泌体释放到细胞外[3]。

外泌体载体综合了细胞药物递送和纳米技术优势,几乎所有细胞都能主动分泌外泌体,这个过程由多种细胞因子介导,选择性地将特定生物活性分子分选到外泌体中。已有研究表明,外泌体是细胞与细胞之间发挥通信作用的关键组成,不仅可通过其表面配体分子直接识别并接触和激活相应的受体细胞,还可以通过内吞作用将“货物”转移到受体细胞,从而发挥细胞间信号转导作用[1,4]。这个过程依赖于外泌体膜表面的蛋白信号分子,这些分子与靶细胞表面的特定分子通过受体配体结合,引发内吞或膜融合,将外泌体中携带的信息物质传递给靶细胞,进而改变靶细胞的生理状态。

2 外泌体的分离提纯及鉴定

2.1 外泌体的分离提纯方法

截至目前,还没有任何一种有效的方法能同时保证外泌体的含量、 纯度、 生物活性[5]。当前的研究主要集中在外泌体作为治疗靶标、药物或基因载体及作为疾病标志物的应用。鉴定外泌体的方法主要是根据外泌体的生物学性状如形态学观察,结合其所含蛋白质及核酸等物质进行分析。常见的外泌体分离提纯方[5-6]法如表1。

表1 外泌体分离提纯方法比较Tab.1 Comparison of methods for the separation and purification of exosomes

2.2 外泌体的鉴定方法

2014年国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 提出,对于体外分离获取的外泌体需要从三个层面进行鉴定[7]:WB检测外泌体标志蛋白的表达情况,即外泌体囊泡膜上含有能够运输外泌体的跨膜蛋白家族(CD63/CD81/CD9、热休克蛋白家族(HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90)和一些细胞特异性蛋白。外泌体形态结构鉴定采用透射电子显微镜,电镜具有较高的分辨率,可通过直接观察样品鉴定外泌体形态。外泌体粒径和浓度采用纳米颗粒示踪分析检测技术进行检测。纳米颗粒示踪分析检测技术可快速且能够精准地分析出外泌体的粒径大小及浓度。YU M 等[8]研究经阿伐他汀预处理后的骨髓间充质干细胞(BMSC)外泌体是否具有促血管生成能力时,对 BMSC来源的外泌体进行了鉴定,透射电镜观察到各组外泌体的典型球形、膜状结构。WB分析显示,分离的颗粒中均检测到外泌体标志蛋白TSG101和CD81。NTA结果表明,Exos和ATV-Exos 均在大约 80～120 nm处显示单峰。

3 外泌体载药

3.1 外泌体的载药类型

外泌体的天然属性使其成为非常有潜力的药物递送载体,可用于递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。外泌体的载药类型主要分为三大类,即药物递送系统(doxorubicin, paclitaxel, curcumin, temozolomide)、核酸递送系统(siRNA, miRNA, mRNA, DNA plasmid)、蛋白递送系统(catalases)[9]。

3.2 外泌体的载药方式

目前,将药物等小分子物质载入外泌体的方式主要有两种,即内源性装载(Pre-loading)和外源性装载(post-loading)。

第一种是对亲本细胞进行修饰,使其分泌的外泌体载有功能分子即内源性装载(Pre-loading)。在生物发生过程中,亲本细胞产生外泌体之前就可以把治疗分子在外泌体生成过程中整合到外泌体内,让细胞成为载药外泌体的活工厂,直接生成想要的外泌体。内源装载思路是:在产生外泌体的细胞上做文章,根据外泌体产生的过程对细胞进行适当改造(通常涉及蛋白/多肽的融合表达、基因药物的过表达等),让其产生携带目标分子的外泌体。但与外源装载相比,内源装载的实验难度更大,周期更长。内源性外泌体装载机制研究尚不完全清楚。Ran等[10]为了检测外泌体作为前肽递送载体的可行性,构建编码前肽抑制域的融合蛋白,将其插入至外泌体跨膜CD63的第二细胞外环当中,使得前肽可表达在外泌体的表面,转导表达前肽的慢病毒(CD63-propeptide-expressing lentivirus)进入小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),生成表达前肽的外泌体(EXOpro),通过小鼠腹腔注射表达前肽的外泌体的特异性与野生型小鼠血清中成熟的肌生成抑制素相结合,从而发挥相应的治疗作用。Choi等[11]设计两种蛋白表达载体,构建可以稳定表达CIBN-EGFP-CD9 和srIκB-mCherry-CRY2两种重组蛋白的细胞株,利用460 nm的蓝光照射,诱导细胞主动将抗炎性蛋白装载至外泌体中,从而进行可控的蛋白互作。EXPLOR系统的优势:可轻松携带需要的重组蛋白,不需分离纯化;经基因改造的细胞可简单便捷的生产目的外泌体,在外泌体蛋白治疗商业化中有巨大潜力;可与个性化治疗兼容,生产根据患者定制的药物递送系统,从而减少宿主免疫反应。Fu等[12]基于体内自组装外泌体siRNA的策略,实现了siRNA从表达到装载再到递送的全体内自动化过程,体外构建可表达siRNA的基因环路,灵活的实现多个siRNA和靶向肽段的插入。核心环路:不带靶向标签,用于系统性siRNA的递送。自组装环路:带靶向标签,用于靶向性siRNA的递送。可编辑基因环路的优势:以宿主自身组织细胞分泌的外泌体为载体,解决了以siRNA作为器官或者组织细胞递送载体所带来的各种问题,如免疫源性高和细胞或组织器官毒性高等问题,对基因环路的灵活编辑,可同时传输多个siRNA,对疾病进行多靶点打击,特异性的靶向肽段可高效的将siRNA输送到特定的组织,克服血脑屏障等生物屏障的制约。

第二种是对新分离提取到的高质量的外泌体进行修饰,即外源性装载(post-loading)。相比内源装载,外源装载操作更简单,批次间的稳定性更高,更适合放大化生产。在分离天然外泌体后,对收集到的外泌体进行相应的药物装载,分为多种不同的装载方式,见表2。

表2 外泌体药物装载方式比较Tab.2 Comparison of exosomal drug loading method

已有研究证实,抗癌药物如紫杉醇(PTX)[13]和阿霉素(DOX)[14]能够通过成功载入外泌体,进而用于抗肿瘤治疗。通过利用外泌体运送紫杉醇到对应的肿瘤部位进行抗肿瘤的研究中,由于间充质干细胞(MSC)可自主归巢至肿瘤微环境且不通过基因操作就能运输紫杉醇,有效的输送紫杉醇且不破坏其生物活性,小泡溶液蛋白质浓度较低时就可诱导肿瘤细胞凋亡。在体外对癌细胞的抑制效果方面,这种方式的抑制效果与单纯使用紫杉醇的效果相比基本一致。应用外泌体在体外成功运输紫杉醇的案例成为外泌体运载抗癌药物进行体内肿瘤治疗的重要证据。姜黄素是一种黄色色素,主要提取于姜黄的根茎中,具有抵抗炎症、促进肠胃蠕动、抵抗恶性细胞增殖、疏风散寒、抗氧化、抗血管生成及保护肝脏、提高肝脏解毒能力等功效。与紫杉醇和阿霉素的作用功效类似,姜黄素在临床应用方面也存在着众多问题,如较低的水溶性、体内代谢速度快,因此在机体能被快速清除。外泌体作为包载姜黄素[15]和大黄素[16]的载体,可以天然提高姜黄素和大黄素在机体水环境中的溶解性、稳定性和生物利用度等。

3.3 外泌体的载药优势

目前,外泌体作为一种极有价值的天然药物递送载体逐渐得到广泛深入地开发和研究。传统药物往往因为水溶性差、生物相容性差、易被人体机体排除、向细胞内渗透的能力低和体内分布不均等众多缺陷性问题限制了其在临床上的广泛应用。外泌体作为具有纳米级别的天然外囊泡,相比其他传统的药物递送系统具有显著地优势:①释放到细胞外的外泌体可以作为细胞间的天然信号传递信使,发挥细胞间通讯(尤其是远距离通讯)作用。外泌体具有良好的生物相容性、无毒且免疫原性低。而人工合成的纳米载体如在机体经多次给药后就可诱发机体适应性免疫应答反应,进而被机体内免疫系统快速清除,并可能激发异常的免疫应答如过敏反应等不良的相关事件发生[1,17]。②外泌体天然的“回巢”能力说明其在体内外药物递送中可能存在潜在应用价值。外泌体通过特异性识别并结合到相应细胞,是借助细胞膜表面的表达受体或细胞外基质中相关的结合蛋白等众多信号分子共同作用的结果,最终不同细胞来源的外泌体进行定向性或趋向性的细胞迁移,能靶向到特定的组织和器官,摄取协同的药物载体,同时保护携带的治疗分子(如miRNA等),减少其在体内的降解。③外泌体作为脂质包裹的小囊泡,能够快捷有效地穿过生物膜,包括血脑屏障、血气屏障、滤过膜和细胞质膜等在内的各种生物屏障,实现药物递送[9,18]。当然,对外泌体的研究还可进行工程化改造等。

4 结论

近年来,在癌症治疗中,将抗癌类药物运输到达癌症部位成为癌症治疗的关键技术问题,引起了各领域研究者们的众多关注。药物载体种类较多,但目前在研究中使用比较广泛的有两类,一是以聚合物作为载体,另一是以脂质体作为载体。而这些药物载体依然存在着稳定性差、在血液中驻留时间短、易被机体免疫系统清除、药物靶向性较低等问题。药物的靶向递送一直是治疗机体各个系统疾病急需解决的关键问题之一,因此需要一种新的、安全的、有效的药物递送载体[9,19]。

外泌体以细胞分泌纳米级的小泡在细胞与细胞间及细胞内部的信息交流过程中发挥着重要作用,并因在人体内广泛分布能顺利穿过细胞膜且不会引起机体细胞的免疫反应,这也是其能够成为药物载体的独特优势,成为运输基因、抗肿瘤、抗炎等类药物的新途径。目前,在临床疾病治疗中,已有使用外泌体进行安全性治疗的临床结果[1,20],但对外泌体在靶向药物递送过程中许多环节涉及到的重要技术尚不清楚,还有重多难题需要解决。外泌体是如何携载“货物”递送至机体各个系统,这一机制还有待进一步的阐明。应用外泌体载药递送技术治疗临床疾病,外泌体的提纯、质量、产量、产业化生产、载药效率、存储条件和载药稳定性等都是其相关技术在临床实践过程中非常重要的评定因素[20]。如何解决以上系列问题、促进纳米药物载体的有效递送系统从实验室进入临床应用,目前的技术条件仍相当有限,亟待更新技术克服这些困难。