丹芪护肝方对肝纤维化模型大鼠TGF-β/Smad4信号通路的影响

彭馥芝 徐仪昕 蒋 堃 陈思源 余曦明 张 逢 余望贻

湖南中医药大学科技创新中心，湖南长沙 410208

肝纤维化是肝脏对自身免疫性、病毒性、药物性等多种慢性损伤的病理性修复反应[1-2]。其发生的中心事件是：在各种慢性损伤因素影响下，肝星状细胞被活化，转化为肌成纤维细胞，与肝脏微环境中的淋巴细胞、内皮细胞等协同作用，通过自分泌等方式共同促进肝脏炎症及纤维化进程[3-4]。因此，在肝纤维化的发生和发展过程中，许多细胞因子以及细胞内的各种信号通路均能对其产生影响[5-8]。丹芪护肝方由丹参、黄芪、女贞子等组成，具有平肝清热，活血行气的功效，临床上用于慢性乙型肝炎和湿热血瘀兼肾虚者，但尚未发现有文献报道丹芪护肝方对肝纤维化的影响。本研究通过制备大鼠肝纤维化动物模型，探讨丹芪护肝方对肝纤维化的保护作用。并通过检测转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/信号通路通用调节因子4（SMAD family member 4，Smad4）信号通路变化，初步揭示丹芪护肝方对肝纤维化的可能机制，以期为临床诊疗上丹芪护肝方的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级SD（sqrague dawley）大鼠48只，雌雄各半，体重140～160 g（实验动物质量合格证号：430727211100469235），购自湖南斯莱克实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2019-0004]；饲养于湖南中医药大学实验动物中心，自由进食及饮水，温度20～25℃，相对湿度为55%～65%。本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查批准通过（伦理号：LL2021031704）。

1.2 实验药物与试剂

联苯双酯滴丸（批号：A02J181131）；四氯化碳（批号：C11588428）；大豆油（批号：C17900081）；逆转录试剂盒（PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser，批号：RR047B）；染料法荧光定量试剂盒（SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ，批号：RR82LR）；Trizol总RNA提取试剂（批号：DP424）；平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（批号：BS-10196R）、TGF-β1（批号：BS-0086R）、Smad4（批号：BS-0585R）单克隆抗体；RIPA裂解缓冲液（批号：JH-23075）；BCA（bicinchoninic acid assay）；蛋白定量试剂盒（批号：FV-87028354）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝胶配制试剂盒（批号：20197701）。

1.3 动物造模及给药

48只SD大鼠被随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组（阳性药物对照组）、丹芪护肝方组，每组12只。四氯化碳（CCL4）与大豆油按比例配成40% CCL4混合溶剂后，2次/周，腹腔注射8周，制备大鼠肝纤维化模型。丹芪护肝方由丹参10 g、黄芪12 g、女贞子10 g、白花蛇舌草30 g、白芍15 g、郁金10 g组成。所有药材均从湖南中医药大学第一附属医院统一购买，在湖南中医药大学药学院实验室煎制。将所有药材放入适量水中进行浓煎至200 ml，口服，1 次/d。根据不同种属动物间用药剂量换算系数[9]（参照60 kg成人进行等效剂量换算），自造模之日起，联苯双酯组（50 mg/kg）和丹芪护肝方组（9.14 g/kg）给予相应药物治疗，模型组和正常对照组灌胃等体积的生理盐水，1 次/d，连续8周。

1.4 肝脏指数测定

末次给药后禁食24 h，2%的戊巴比妥钠（2 ml/kg）进行腹腔注射麻醉。腹主动脉取血后立即摘取肝脏，经冲洗、滤纸吸干水分后称量湿重并计算肝脏指数：脏器指数=脏器湿重（g）/大鼠体质量（g）×100%。

1.5 肝功能测定

麻醉后腹主动脉取血，室温静置2 h，于4 ℃，3500 r/min，离心15 min后取血清使用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，T-BiL）、直接胆红素（direct bilirubin，D-BiL）。

1.6 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织中α-SMA、TGF-β1和Smad4 mRNA表达

提取各组大鼠肝组织中总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），检测RNA完整性和纯度后，进行RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增。RT-PCR扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s扩增，40个循环；55～95℃熔解30 s。采用2-△△Ct公式计算α-SMA、TGF-β1及Smad4 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列信息

1.7 蛋白免疫印迹（western blot，WB）检测肝组织中α-SMA、TGF-β1和Smad4蛋白表达

提取各组大鼠肝脏组织蛋白，采用BCA法对各组蛋白样品进行定量。SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜封闭2 h。封闭完成后，用α-SMA（1∶10000）、TGF-β1（1∶1000）、Smad4（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）抗体孵育过夜。等渗缓冲盐溶液（TBS with Tween-20，TBST）洗涤以除去残留的一抗，二抗室温孵育1.5 h，TBST洗涤后，放入化学发光成像仪内化学发光显影。

1.8 统计学方法

使用SPSS 22.0统计学软件进行数据统计分析，差异显著性用单因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法进行多重比较。计量资料以均数±标准差（）表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 丹芪护肝方对肝脏指数的影响比较

与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏指数升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与模型组比较，联苯双酯组和丹芪护肝方组肝脏指数均降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝脏指数的影响（ ± s）

表2 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝脏指数的影响（ ± s）

注 与正常对照组比较，▲P ＜ 0.05；与模型组比较，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

组别 n 肝重（g） 肝脏指数（%）正常对照组 12 16.94±0.97 3.14±0.41模型组 12 21.42±1.50▲ 5.11±0.49▲联苯双酯组 12 18.86±1.16★★ 4.54±0.58★丹芪护肝方组 12 19.89±0.65★ 4.39±0.58★

2.2 丹芪护肝方对肝功能的影响比较

模型组大鼠血清中ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量与正常对照组比较，均显著升高，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；与模型组比较，联苯双酯组和丹芪护肝方组大鼠肝功能指标ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量均明显下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝功能的影响（ ± s）

表3 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝功能的影响（ ± s）

注 ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；T-BiL：总胆红素；D-BiL：直接胆红素；与正常对照组比较，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；与模型组比较，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

组别 n ALT（U/L） AST（U/L） T-BiL（μmol/L） D-BiL（μmol/L）正常对照组 12 46.18±3.92 27.31±2.23 0.71±0.11 0.78±0.09模型组 12 192.36±7.79▲▲ 83.12±5.26▲▲ 2.77±0.35▲▲ 2.15±0.21▲▲联苯双酯组 12 101.37±5.14★★ 49.94±3.78★★ 2.17±0.21★ 1.97±0.22★丹芪护肝方组 12 115.66±4.98★★ 53.74±3.37★ 2.16±0.32★ 1.84±0.19★

2.3 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝组织 α-SMA表达的影响比较

模型组大鼠肝组织α-SMA mRNA和蛋白表达与正常对照组比较均升高，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），提示肝星状细胞被激活，肝纤维化发生。与模型组比较，联苯双酯组和丹芪护肝方组大鼠肝组织α-SMA mRNA和蛋白表达量均降低，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）。见图1。

图1 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA表达的影响

2.4 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β/Smad4信号通路的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白相对表达量升高，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；与模型组比较，联苯双酯组和丹芪护肝方组大鼠肝组织TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白相对表达量降低，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；联苯双酯组TGF-β1、Smad4蛋白及mRNA表达均低于丹芪护肝方组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图2。

图2 丹芪护肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1、Smad4表达的影响

3 讨论

目前中医药治疗以其独特的优势，成为研究肝纤维化防治的重要方向之一。丹芪护肝方以丹参、黄芪为疏肝要药，疏泄肝气，调畅气机；配伍女贞子、蛇舌草、白芍、郁金，调和诸药共为佐使。全方合用具有疏泄气机，化瘀活血的作用。

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是一种肝间质细胞，HSC被激活后能合成并分泌细胞外基质，产生胶原酶，成为肝纤维化发生、发展的中心环节[10-11]。研究表明，当α-SMA表达水平升高时，HSC被激活，进而诱导肝纤维化的发生[12-13]。本研究发现，肝纤维化模型大鼠的α-SMA表达显著上升，而丹芪护肝方干预后，α-SMA蛋白及mRNA表达水平均明显下降，提示丹芪护肝方也能通过抑制肝星状细胞活化来抑制肝纤维化。

TGF-β是目前公认的细胞分化过程中最关键的细胞因子，而TGF-β1是目前研究最多的TGF-β亚型，具有广泛的生物学活性，对细胞增生、迁移、分化及凋亡均有重要影响[14]。研究表明，作为重要的促肝纤维化因子之一，TGF-β1能刺激HSC分泌细胞外基质降解蛋白酶抑制剂，增加细胞外基质沉积，促进成纤维细胞分化，从而引发肝纤维化[15-18]。因此，TGF-β1水平在肝纤维化时最高，通过下调TGF-β1的表达，抑制HSC的活化，减少细胞外基质沉积，进而延缓肝纤维化的进程[19-20]。Smad4是TGF-β1介导纤维化和炎症的关键调节因子[21]。Smad4的条件性缺失可抑制纤维化和TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原的表达[22]。研究证实，肝纤维化过程中，各类损伤因子会导致肝脏内TGF-β1表达大量增加，TGF-β1通过与靶细胞表面的TGF-β 受体结合，激活下游信号传导分子，与Smad4 结合形成多聚体后转移进入细胞核，在细胞核内与靶基因结合，形成转录复合体，被激活的目的基因通过复制、转录产生大量胶原，最终形成肝纤维化[23-25]。本实验研究结果还发现，丹芪护肝方能够抑制肝纤维化大鼠TGF-β1和Smad4的表达，提示丹芪护肝方可能通过调控TGF-β/Smad4信号通路抑制肝纤维化。

综上所述，丹芪护肝方能够通过抑制TGF-β/Smad4信号通路，抑制肝星状细胞活化，抑制肝纤维化发挥护肝作用。