黄小静 张天聪 高雪梅 何翠 宦宣容 李远
摘要:目的 應用微流控芯片技术和流式细胞术体外分析剪切力作用下替格瑞洛的抗血小板疗效。方法 采用微流控芯片技术检测300/s、1500/s剪切率条件下替格瑞洛对血小板聚集行为的影响,以血小板聚集体表面覆盖率为量化指标,计算替格瑞洛半抑制率;运用光学比浊法验证替格瑞洛抑制ADP诱导的血小板聚集效应;应用微流控芯片构建体外狭窄血管模型,探究高剪切率作用下血小板反应性,并采用流式细胞术分析替格瑞洛对高剪切诱导活化的血小板膜表面纤维蛋白原受体(PAC-1)和P-选择素(CD62P)表达的影响。结果 在300/s、1500/s剪切率流动条件下,替格瑞洛呈浓度依赖性抑制血小板聚集,300/s较1500/s抑制程度更明显(P均<0.001),当浓度≥4 μmol/L时几乎完全抑制血小板聚集;替格瑞洛抑制ADP诱导的血小板聚集效应与流动条件下的结果相似,亦呈浓度依赖性抑制血小板聚集;替格瑞洛能够抑制PAC-1和CD62P的表达。结论 应用微流控芯片技术分析血小板聚集和流式细胞术检测血小板活化,与仅用ADP诱导的基于聚集的分析相比,可确定不同患者对替格瑞洛反应的差异性。
关键词:微流控芯片;流式细胞术;替格瑞洛;血小板聚集;剪切率;剪切诱导活化
中图分类号: R446.11文献标志码: A文章编号:1000-503X(2023)02-0257-07
DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15155
Microfluidic Chip and Flow Cytometry for Examination of the Antiplatelet Effect of Ticagrelor
HUANG Xiaojing,ZHANG Tiancong,GAO Xuemei,HE Cui,HUAN Xuanrong,LI Yuan
ABSTRACT:Objective To examine the antiplatelet effect of ticagrelor by microfluidic chip and flow cytometry under shear stress in vitro.Methods Microfluidic chip was used to examine the effect of ticagrelor on platelet aggregation at the shear rates of 300/s and 1500/s.We adopted the surface coverage of platelet aggregation to calculate the half inhibition rate of ticagrelor.The inhibitory effect of ticagrelor on ADP-induced platelet aggregation was verified by optical turbidimetry.Microfluidic chip was used to construct an in vitro vascular stenosis model,with which the platelet reactivity under high shear rate was determined.Furthermore,the effect of ticagrelor on the expression of fibrinogen receptor (PAC-1) and P-selectin (CD62P) on platelet membrane activated by high shear rate was analyzed by flow cytometry.Results At the shear rates of 300/s and 1500/s,ticagrelor inhibited platelet aggregation in a concentration-dependent manner,and the inhibition at 300/s was stronger than that at 1500/s (both P<0.001).Ticagrelor at a concentration ≥4 μmol/L almost completely inhibited platelet aggregation.The inhibition of ADP-induced platelet aggregation by ticagrelor was similar to the results under flow conditions and also in a concentration-dependent manner.Ticagrelor inhibited the expression of PAC-1 and CD62P.Conclusion We employed microfluidic chip to analyze platelet aggregation and flow cytometry to detect platelet activation,which can reveal the responses of different patients to ticagrelor.
Key words:microfluidic chip;flow cytometry;ticagrelor;platelet aggregation;shear rate;shear-induced activation
Acta Acad Med Sin,2023,45(2):257-263
血小板黏附和聚集是正常止血和病理性血栓形成的基础[1],血小板活化是止血和血栓形成的重要环节。有研究证实血小板活化和聚集依赖于流体剪切力[2]。高剪切力可以触发血小板细胞内信号传递,激活其表面受体糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和糖蛋白Ⅰbα,循环中的血小板通过其表面受体识别纤维蛋白原和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)等黏附蛋白,随后血小板被激活,通过释放 ADP和血栓素 A2等可溶性激动剂从血液中募集其他血小板,经信号级联放大和调节最终形成血小板聚集体。替格瑞洛是一种直接作用的P2Y12受体拮抗剂,不需要代谢,它可逆地与P2Y12受体结合在不同于ADP结合位点的位置,抑制ADP通道诱导的血小板聚集[3]。目前指南提出替格瑞洛作为急性冠脉综合征患者首选的抗血小板药物,用于预防和治疗成人急性冠脉综合征患者的血栓栓塞症[4]。然而,服用替格瑞洛的患者仍可能出现血栓形成或出血并发症[5-6]。基于血小板对剪切力的反应性测试的抗血小板治疗可能会减少这些并发症。目前,尽管已有椎板分析仪、血小板功能分析仪PF-100/200等几种基于剪切力的仪器用于评估剪切率条件下抗血小板药物对血小板功能的影响[7-9]。然而,这些设备连续剪切血小板以评估不同的抗血小板药物,没有考虑到血小板之间的瞬时相互作用和增加的剪切力,在测试体内血小板所经历的血流动力学环境中抗血小板药物的有效性方面能力有限。因此,本研究利用微流控芯片通过模拟体内微血管尺寸和结构特征以精准调控的微流体动力学研究血小板功能。此外,近年流式细胞术被广泛用于基础和临床研究,成为检测血小板活化的重要手段。本研究采用微流控芯片技术和流式细胞术研究血小板对剪切力的反应性,以期能够为替格瑞洛的疗效提供更多的信息。
材料和方法
仪器 IX71倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司,单色制冷CCD相机购自美国Photometrics公司,PSP01-CS双向推拉型精密注射泵购自嘉善瑞创电子科技有限公司,PDG-32G-2等离子清洗机购自德国Harrick公司,Streampix 7.0视频录制软件购自加拿大Norpix公司,Varioskan Flash多功能酶标仪购自美国Thermofisher公司,CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。
试剂 Sylgard 184聚二甲基硅氧烷购自美国Dow Corning公司,替格瑞洛和ADP购自美国Topscience公司,Calcein AM荧光染料、Anti-Human CD61-PerCP-eFluorTM710、Anti-Human CD62P-PE和Anti-Human PAC-1-FITC均购自美国Invitrogen公司,3.2%柠檬酸钠抗凝真空采血管购自山东威高采血耗材有限公司,4%多聚甲醛溶液购自上海碧云天生物技术有限公司,牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)购自上海生工生物工程有限公司。
血液样品采集和处理 12名健康志愿者由重庆市血液中心永川分中心招募,志愿者1个月内无影响血小板功能服药史,其血常规和凝血功能(活化部分凝血酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间和纤维蛋白原)检测指标均在正常参考值范围内。真空采血管采集静脉血液样品,全血样品以3.2%柠檬酸钠抗凝,室温放置,2 h内使用。将每名志愿者抗凝全血均分为5等份,其中4份作为处理组,分别加入不同浓度的替格瑞洛(终浓度0.5、 1.0、 2.0、 4.0 μmol/L),剩余1份加入PBS作为对照组。最后,将浓度为 2 mmol/L Calcein AM荧光染料按 1∶500(v/v)加入到 5 组血液样品中,轻轻吹打混匀后,在37 ℃静止孵育 30 min,对血小板进行荧光标记。
微通道芯片设计、加工和处理 微通道芯片设计、加工和处理参考课题组前期报道[10]。选用宽度和深度分别为700 μm和70 μm的直微通道。在前期研究基础上增加狭窄微通道,模拟小动脉狭窄时的病理性高剪切率。本研究使用的狭窄微通道狭窄处宽度为140 μm(狭窄程度為80%),狭窄长度为0.5 mm,其他组成部分同直通道。
微流控芯片血小板聚集分析 微通道血小板聚集实验参考课题组前期文献报道[11]。本研究设定直微通道壁剪切率为300/s和1500/s,分别代表生理条件下人体静脉和动脉内的血液流动壁剪切率。全血样本灌注到微通道中,持续150 s,采集荧光图像进行分析。
狭窄微通道流体动力学分析 运用Solidworks3D建模软件的有限元分析模块对狭窄微通道的流体动力学进行分析(图1)。设置狭窄微通道的流量为52 μl/min,通过有限元分析壁面剪切率可达到9000/s。狭窄微通道大部分区域的剪切率分布是均匀的,狭窄微通道长度为0.50 mm,上下游剪切率梯度变化区域位于狭窄微通道前后0.75 mm处,梯度从狭窄微通道向两端递减。抗凝全血通过狭窄微通道灌注,其中血小板进入高剪切力的上游区域,随后流出到较低剪切力的区域,聚集在较低剪切力区域逐渐形成稳定的血小板聚集体。因此,本研究血小板聚集图像选择狭窄下游0.75 mm处的聚集区域。
光学比浊法血小板聚集效应验证 ADP诱导的血小板聚集采用基于96孔板的光学比浊法进行分析[12]。将抗凝全血167×g离心10 min,获取上层富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP);将PRP 3000×g进一步离心15 min,获取上层贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP);将PRP与不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L)的替格瑞洛37 ℃孵育30 min;在96孔板中加入5 μl ADP(终浓度为5.0 μmol/L)或PBS;取100 μl 替格瑞洛处理的PRP加入到96孔板,作为参考,将100 μl PRP或PPP加入到PBS的孔中,将96孔板37 ℃震荡孵育15 min后用Varioskan Flash多功能酶标仪结合SkanIt Software 2.4.3 RE for Varioskan Flash软件测试溶液在572 nm处波长的吸光度,结果报告为光密度值(optical density,OD)。实验以PPP和PRP的溶液作为对照孔,其吸光度分别代表血小板聚集率为100%和0,并依此计算加入不同浓度替格瑞洛的血小板聚集率,血小板聚集率(%)=[OD(PRP)-OD(样本)]/[OD(PRP)-OD(PPP)]×100。
流式细胞术血小板活化分析 抗凝全血(阳性对照)和替格瑞洛(终浓度2.0 μmol/L)处理的全血在37 ℃静止孵育30 min后,将血液灌注到牛血清白蛋白封闭的80%狭窄微通道中,在52 μl/min体积流量下收集血液样品,各取5 μl与抗人CD61、CD62P、PAC-1室温下避光孵育20 min;在灌注前,先标记1份血液作为阴性对照。标记后的样品加入1%多聚甲醛1 ml,充分混匀固定10 min,用流式细胞术三色荧光分析CD62P和PAC-1的表达,用Flowjo 10.5.3进行数据分析。
统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差表示。多组均值比较采用随机区组设计方差分析,采用LSD检验进行多重比较,两组均数比较采用配对t检验,采用Shapiro-Wilk 实验进行正态性检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
两种生理性剪切率条件下替格瑞洛疗效 不同终浓度替格瑞洛处理组在300/s、1500/s剪切率条件下流动150 s后,其典型的血小板黏附聚集荧光图像显示300/s条件下血小板聚集体较小,分布无方向性,1500/s条件下血小板聚集体较大,沿流动方向延伸(图2)。在两种剪切率条件下替格瑞洛均显著降低血小板表面覆盖率,且呈浓度依赖性,其中2.0 μmol/L浓度下替格瑞洛能够稳定抑制血小板聚集,4.0 μmol/L浓度下血小板几乎不发生聚集,300/s相较1500/s降低程度更明显(P均<0.001)。进一步分析显示,替格瑞洛浓度与血小板表面覆盖率能进行良好拟合,绘制拟合的量-效关系曲线并得出300/s和1500/s剪切率下替格瑞洛对血小板黏附聚集的半抑制率分别为0.376、1.364 μmol/L(图3)。
ADP诱导条件下替格瑞洛疗效 基于传统的光学比浊法测试显示,对照组ADP诱导的血小板聚集率为(80.1±1.1)%,0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L替格瑞洛处理组的血小板聚集率分别为(65.5±5.1)%、(41.0±6.2)%、(22.0±1.4)%、(6.8±5.2)%,血小板聚集率呈浓度依赖性降低。与剪切力诱导的聚集结果相似,2.0 μmol/L浓度下替格瑞洛的抑制率大于50%,可用于后续病理性高剪切率对血小板活化和聚集的研究。
病理性剪切率条件下替格瑞洛对血小板活化和聚集的影响 将荧光素标记的抗血小板单克隆抗体免疫荧光染色的标本在流式细胞仪上分析,以CD61 PerCP/SSC双参数设定血小板门,分析PAC-1和CD62P阳性血小板百分率。与对照组相比,替格瑞洛处理组显著降低P-选择素(CD62P)[降低13.44%(t=5.390,P =0.033]和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体(PAC-1)[降低12.30%(t=8.059,P =0.015)]的表达。病理性高剪切率条件下,与对照组相比,替格瑞洛处理后血小板聚集体较小,且显著降低血小板聚集体表面覆盖率[降低22.91%(t=12.190, P=0.007)](图4)。
讨论
替格瑞洛通过可逆阻断P2Y12受体结合,抑制糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体活化及纤维蛋白原连接从而抑制血栓的形成。尽管替格瑞洛抗血小板机制已经十分清楚,但剪切力作用下替格瑞洛抑制血小板活化聚集行为的确切机制尚不清楚。本研究采用微流控芯片分析剪切力诱导的血小板聚集体的荧光图像显示,在300/s和1500/s剪切率条件下,替格瑞洛能显著抑制血小板黏附聚集,并呈浓度依赖性,但血小板聚集体不会被完全抑制。推测原因可能为替格瑞洛抑制了ADP通路诱导的血小板聚集,少量血小板仍然可以通过花生四烯酸-环氧合酶-血栓素 A2等途径发生聚集。值得注意的是,替格瑞洛在300/s剪切率流動条件下抑制血小板聚集程度较1500/s剪切率大,提示替格瑞洛抑制血小板聚集效应与剪切率大小相关。在相对较低剪切率条件下(<1000/s),血小板聚集依赖于糖蛋白Ⅱb/Ⅲa-纤维蛋白原相互作用,这种相互作用可以独立于vWF-糖蛋白Ⅰb发生;当剪切率在1000~10 000/s时,血小板相互作用逐渐变得更加依赖于vWF、糖蛋白Ⅰb和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[13]。有报道持续的ADP-P2Y12信号转导对于维持糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的活性构象水平以促进血小板聚集体的稳定至关重要[14-15]。因此,认为阻断ADP-P2Y12可能对300/s剪切率下的血小板聚集影响更大。替格瑞洛对血小板聚集的影响进一步采用光学比浊法进行验证,本研究选用ADP作为血小板激动剂,用于评估替格瑞洛调控血小板聚集的P2Y12-APD受体途径,结果显示替格瑞洛呈浓度依赖性显著抑制血小板聚集,在浓度为2.0 μmol/L时能够稳定抑制血小板聚集,该结果与替格瑞洛抑制剪切率条件下血小板聚集的结果相似,符合预期的理论。本研究表明替格瑞洛不仅减弱ADP途径诱导的血小板聚集反应,而且对剪切诱导的血小板聚集反应也有强的抑制作用。
在心脑血管动脉血栓性疾病中,血管狭窄可导致血流受到远高于生理水平的剪切力,这种高剪切力在体外可以直接诱导血小板迅速活化/聚集[16-18]。PAC-1是糖蛋白Ⅱb/Ⅲa活化后暴露的纤维蛋白原结合位点,即活化的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa;CD62P是静息血小板α颗粒膜蛋白成分,血小板活化时发生脱颗粒反应,α颗粒膜迅速与血小板融合,P-选择素转移到血小板表面或脱颗粒成为可溶性P-选择素,这种蛋白可作为血小板活化的标志物[19,20]。本研究采用狭窄微流控芯片提供高剪切作用,通过流式细胞仪分析替格瑞洛降低活化糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和P-选择素的表达,表明替格瑞洛能够抑制剪切率诱导的血小板活化,与Goto等[21]报道的实验结果相符,即阻断血小板释放的ADP对P2Y12的活化可抑制vWF-糖蛋白Ⅰb相互作用引发的血小板活化。流式细胞术测量剪切诱导的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa活化、P-选择素表达可以深入了解接受抗血小板治疗的患者的抑制状态,并可能识别出更严格的抗血小板治疗中血小板抑制程度不佳的患者。
综上,本研究的血小板黏附聚集功能微流控芯片技术可分析不同剪切率条件下血小板功能反应性差异,联合流式细胞术可用于出凝血功能临床诊断及抗血小板药物个性化用药分析,未来可进一步研究这两种检测方法在监测治疗中的血小板反应性方面的价值。
参 考 文 献
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(收稿日期:2022-06-14)
基金項目:国家自然科学基金(11702047)、重庆市社会事业与民生保障科技创新专项(cstc2017shmsA130009)、重庆市医学科研计划项目(2017MSXM079)和重庆市博士后科研流动站项目(Xm2017082)