基于网络药理学及分子对接探讨三味药食两用中药治疗单纯性肥胖的机制

王相安 王慧铭　

基于网络药理学及分子对接探讨三味药食两用中药治疗单纯性肥胖的机制

王相安1王慧铭2

（1.浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003；2.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053）

目的：基于网络药理学和分子对接方法，探讨山楂、荷叶、决明子的有效成分治疗单纯性肥胖的作用机制。方法：从TCMSP中获取决明子及荷叶的活性成分，利用TCMID及ETCM并结合相关文献获取山楂果肉的活性成分，最后通过TCMSP获取上述活性成分对应的靶点。通过GeneCards、OMIM数据库收集单纯性肥胖靶点，同时，利用Venny 2.1.0获取“药物－疾病”交集靶点，通过STRING平台构建PPI网络图，并用CytoNCA插件筛选出关键靶点。利用Metascape数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析。最后，利用AutoDock Vina 1.1.2对关键靶点和成分进行分子对接。结果：通过筛选共获得38种活性成分，180个“药物－疾病”交集靶点，PPI网络图筛选出9个核心靶点；GO分析获得2 338个条目，KEGG分析得到204条信号通路；分子对接结果显示关键靶点与核心活性成分具有较好的结合活性。结论：山楂、荷叶、决明子通过多成分、多靶点、多通路治疗单纯性肥胖。

药食两用；单纯性肥胖；网络药理学；分子对接

引言

单纯性肥胖是指发病机制尚未明确，由于体内脂肪堆积过多或分布异常而引起的慢性代谢性疾病，是高血压、糖尿病、睡眠呼吸暂停综合征、高脂血症、骨关节炎发病的独立危险因素[1]。2019年的统计数据显示，我国肥胖人口已悄然跃居全球首位，肥胖男性和女性的人数分别占全球肥胖症患者的16.3%和12.4%[2]。目前，西医治疗该病主要采用行动干预为主。尽管绝大多数人能理解饮食控制及体育锻炼对于体重管理的重要意义，但是鲜少有肥胖症患者能够长期落实相关营养医嘱。在当前批准使用的减肥药中，胰脂肪酶抑制剂在降低脂类吸收的同时也会影响脂溶性营养素的吸收，长期使用还会导致肝肾损伤；而抑制食欲的神经胺类减肥药不仅会引发消化系统不良反应，还可能产生剂量依赖[3]。因此，上述治疗方案带给单纯性肥胖患者的临床获益十分有限。

2021年国家卫生健康委发布的《按照传统既是食品又是中药材的物质目录管理规定》共纳入了86种药食同源中药。由于该规定列举的中药毒副作用甚微，其中的荷叶、决明子、山楂、茯苓、淡豆豉、麦芽、薏苡仁、莱菔子、杏仁、昆布、枸杞子已被搭配为各种减重药膳，广泛应用于单纯性肥胖的营养治疗。传统的饮食治疗主要通过限制脂类及热卡的摄入来减少脂肪积聚，上述中药均为低脂肪食物，其所含植物化学物还可能具有优化体内脂肪分布、改善脂类代谢模式的作用。近期由赵鹏葳主持的研究显示[4]，荷叶、决明子、山楂是具有减重功能的药食两用类中药中使用频次最高的三味，但荷叶、决明子、山楂降低体脂的机制尚不明确。

网络药理学属于一门新兴学科，融合了药理学、系统生物学、计算生物学等多学科的技术和内容，通过大量网络数据库资源，对作用的靶点进行预测，构建多层次的“药物—成分—靶点—疾病”互作网络从微观药理调控基因表达的角度阐释药物多途径、多靶点治疗疾病的机理，为现代药理学技术应用于传统中药研究提供新的模式。本研究利用网络药理学并结合分子对接技术，对题设三味药食两用中药防治单纯性肥胖的机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

分析数据由TCMSP数据库（http://tcmspw.com）、Gene Cards数据库（https://www.genecards.org）、TCMID数据库（http://www.megabionet.org/tcmid）、OMIM数据库（http://www.omim.org）、ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM）、UniProt数据库（https://www.uniprot.org）、STRING数据库（https://cn.string-db.org）、Metascape数据库（https://metascape.org）、PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、PDB数据库（https://www.rcsb.org）获得；运用的软件有Venny 2.1.0在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）、Cytosape 3.7.2软件、AutoDock Vina 1.1.2软件、Chem3D软件、PYMOL2.3.0软件。

1.2 方法

1.2.1 中药的活性成分及作用靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[5]，检索荷叶、决明子的活性成分，其中并没有山楂常用药用部位果肉的条目，只有山楂叶相关条目，故通过中医药综合数据库（TCMID）[6]及中医药百科全书数据库（ETCM）[7]结合知网、PubMed等数据库查阅相关文献以获取山楂果肉部分的活性成分[8-11]。根据药代动力学参数，设定口服利用度OB≥30%且类药性DL≥0.18为条件进行筛选，以获取这三味药物的主要活性成分。将收集的主要活性成分导入TCMSP中，获取相应的靶点。同时，利用UniProt数据库[12]，限定物种为“homo sapiens”，进行校准并得到标准化的靶点名称。

1.2.2 “中药－活性成分－药物靶点”网络的构建

利用筛选出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2上绘制“中药－活性成分－靶点”网络，运行Network Analyzer插件进行拓扑分析，根据degree值大小筛选出核心成分。

1.2.3 疾病相关靶点的筛选

利用Genecards数据库（Relevance Score值≥1.0）[13]和OMIM数据库[14]，以“simple obesity”作为检索词进行检索，合并去除重复值后，最终获得单纯性肥胖的靶点。

1.2.4 药物-疾病共同靶点的筛选

将三味中药的靶点与单纯性肥胖的靶点取交集，并利用Venny 2.1.0绘制Venn图，得到药物-疾病共同靶点。

1.2.5 PPI网络的构建

将“1.2.4”获得的交集靶点导入STRING 11.5数据库中[15]，限定物种为“homo sapiens”，并以置信度≥0.4为条件筛选，获取PPI网络图及TSV格式文件，并导入Cytosape 3.7.2中，运行CytoNCA插件进行拓扑分析，根据中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）等参数筛选出核心靶基因。

1.2.6 通路和功能富集的分析

将“1.2.4”获得的交集靶点导入Metascape平台[16]，将生物种类设定为“homo sapiens”，根据＜0.01，进行GO功能富集分析与KEGG通路分析，并利用R语言进行可视化。

1.2.7 分子对接验证

通过筛选获得核心靶点，然后选取对应的活性成分，利用分子对接软件AutoDock Vina 1.1.2验证预测的上诉活性成分和关键靶点的可信度。首先，在PubChem数据库[17]获得核心活性成分的2D结构，并导入Chem3D中进行优化得到其3D结构。同时利用AutoDock 4.2.6加氢、分配电荷及设置可旋转柔性键后保存为“pdbqt”文件。在PDB数据库寻找靶蛋白的3D结构，运用PYMOL 2.3.0对靶蛋白进行去除水分子及去除配体等操作，同时利用AutoDock 4.2.6对其进行加氢、分配电荷后保存为“pdbqt”文件。最后，利用AutoDock Vina 1.1.2将受体蛋白与配体小分子进行分子对接并用PYMOL2.3.0进行可视化。

2 结果

2.1 中药的活性成分和作用靶点收集

从TCMSP数据库中获取决明子及荷叶的活性成分，从TCMID及ETCM数据库并结合相关文献，获取山楂果肉部分的活性成分。通过设定OB≥30%且DL≥0.18为条件筛选后，最终纳入共活性成分6个，荷叶活性成分9个（除去5个共活性成分及1个没有靶点的活性成分），决明子活性成分12个（除去1个共活性成分及1个没有靶点的活性成分），山楂活性成分11个（除去6个共活性成分）。为了方便研究，荷叶、决明子、山楂的活性成分被标记为“HY1-HY9”“JMZ1-JMZ12”“SZ1-SZ11”。6个共活性成分被标记为A1-F1。将上述38种活性成分导入TCMSP中收集对应的靶点，并用UniProt数据库校准靶点名称，去除重复及无效值后得到238个靶点。

2.2 “中药－活性成分－药物靶点”网络的构建

通过Cytoscape3.7.2绘制中药－成分－靶点网络。图中共含有279个节点（3个中药节点、38个活性成分节点、238个药物作用的靶点节点）和954条边。通过内置的Network Analyzer分析该网络拓扑学参数，并根据degree值大小选取排名前10的核心成分，见表1。

表1 三味中药的关键活性成分信息

2.3 单纯性肥胖靶点的收集与韦恩图的构建

利用GeneCards数据库（Relevance Score值≥1.0）和OMIM数据库，以“simple obesity”为关键词，检索单纯性肥胖的靶点，并将两个数据库得到的靶点合并删除重复值后，共得到2749个靶点，与三味中药相关的238个靶点同时导入Venny 2.1.0进行交集分析并绘制Venn图，共获得180个交集靶点（见图1），即为三味中药治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点。

图1 药物－疾病靶点韦恩图

2.4 PPI网络的构建

将180个交集靶点导入STRING数据库，限定物种“Homo sapiens”，设置置信度≥0.4，剔除1个无相互作用关系的蛋白后，得到由179个节点及3461条边组成的PPI网络（见图2）及TSV格式文件。将TSV格式文件导入Cytoscape3.7.2中，运行CytoNCA插件进行拓扑分析，计算出DC，CC及BC的值。其中，DC的中位数为32，CC的中位数为0.52，BC的中位数为57.95，第一轮筛选设为DC≥32，CC≥0.52，BC≥57.95，共得到64个靶点。第二轮筛选设为DC≥64.5，CC≥0.59，BC≥200.62，共得到24个靶点。最后设定DC≥91，CC≥0.65，BC≥602.51进行第3次筛选，最终得到9个核心靶点，见图3。其中，核心靶点网络节点特征参数，见表2。

图2 核心靶点筛选流程图

表2 核心靶点网络节点特征参数

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

利用Metascape平台，设置＜0.01作为筛选条件，将交集靶点进行GO的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）分析，总共富集到2338个条目，其中1991项BP，206项MF，141项CC，根据−lgP值筛选出排名前10的条目，并利用R语言绘制柱状图，见图3。其中，BP主要涉及细胞对有机氮化合物、对脂质、脂多糖及激素的反应等；CC主要涉及等细胞质膜、激素受体复合物等；MF主要涉及等DNA结合转录因子、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子、配体激活的转录因子活性及细胞因子受体等。

2.5.2 KEGG通路富集分析

利用Metascape平台，设置＜0.01作为筛选条件，将交集靶点进行KEGG分析，共得到204条信号通路，根据−lgP值筛选出排名前20条目，并利用R语言绘气泡图，见图4。主要涉及脂质和动脉粥样硬化途径、糖尿病并发症中的年龄-晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycosylation end-products，RAGE）信号通路、MAPK、FoxO等信号通路。

图3 GO功能分析可视化结果

图4 KEGG通路富集分析可视化结果

2.6 分子对接结果

使用AutoDock Vina 1.1.2软件对degree值排名前5位的关键靶点和活性成分进行分子对接，结果见表3。结合能值越低，二者的结合效果越好，通常以结合能≤-5.0 kJ/mol作为标准。结果显示，各靶点和活性成分之间对接的最低结合能结果均小于-5.0 kJ/mol，说明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性，进一步验证了上述网络药理学的结果。其中，分子对接模式图见图6。

表3 核心活性成分和核心靶蛋白的结合能（单位：kcal/mol）

3 讨论

由于减肥药物副作用较大、减重手术难以推广，运动减肥患者依从性较差且体重极易反弹，故现代医学对肥胖症的治疗手段是相当有限的。而将药食两用中药加入患者日常饮食能充分发挥其安全性高、口感易于接受的优点，是中医药防治肥胖症等代谢相关疾病的特色疗法。基于山楂健脾开胃、消食化滞，决明子清热泻火、润肠通便，荷叶清暑利湿、升发脾阳之功效，此三味药食两用中药被广泛应用于单纯性肥胖的饮食治疗。尽管已有临床观察显示其疗效显著，荷叶、山楂、决明子治疗单纯性肥胖的活性成分、作用靶点及分子机制尚不明确[18-20]。

通过“药物—活性成分—靶点”网络发现，槲皮素、山奈酚、异鼠李素、荷叶碱、杏黄罂粟碱等活性成分的潜在作用靶点丰富，可能是治疗单纯性肥胖的主要成分。其中，槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，通过减少三酰甘油积累、胰岛素抵抗、肥胖相关炎症细胞因子分泌，以及调节脂肪细胞的增值、分化、凋亡而发挥降低体脂的作用[21]。动物实验表明，山柰酚能有效降低高糖高脂饮食喂养的大鼠体质量增加和脂肪堆积，而异鼠李素可以通过下调3T3-L1脂肪细胞中的PPAR-γ和CEBP-α抑制脂肪生成[22]。更重要的是，荷叶碱、杏黄罂粟碱能分别作用于中枢及外周神经元受体，对乙酰胆碱受体发挥调控作用，通过抑制食欲起到降脂减肥的作用[23]。

通过蛋白互作网络发现，AKT1、TP53、IL6、TNF、ESR1等是山楂、决明子、荷叶治疗单纯性肥胖的核心靶点；这与Sneha Rai等报道有关脂质代谢相关靶点的研究相一致[24]。其中，AKT1可促进GSK3β的磷酸化继而调节脂质代谢[25]，TNF-α、IL-6作为炎症因子能促进巨噬细胞对LDL-C的摄取、加速脂质沉积[26]，TP53则可通过调节甲羟戊酸途径，降低体内的胆固醇[27]。此外，ESR1是介导雌激素发挥作用的关键分子，而雌激素能下调PPAR-α活性，促进肝脏脂肪酸氧化，降低肝脏甘油三脂水平[28]。

通过KEGG通路富集分析发现，题设三味中药治疗单纯性肥胖的主要通路包括AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化途径、MAPK、FoxO信号通路。晚期糖基化终产物（AGEs）是蛋白质、脂质和核酸的非酶促糖化和氧化产生的化合物组，高浓度AGEs诱导后，可以使RAGE、SRA2、CD36表达增加，提升巨噬细胞胆固醇的摄取能力[29]。而FoxO1能够促进ApoC-III的表达，从而抑制肝脏摄取极低密度脂蛋白（VLDL）、减少肝脏脂肪浸润[30]。动物实验表明，MAPK磷酸化可以影响肝脏脂质累积，还能在减轻内脏脂肪氧化损伤的同时治疗高脂血症[31]。

分子对接结果显示，上述关键靶点和活性成分之间对接的最低结合能结果均小于-5.0 kJ/mol，说明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性，进一步验证了上述网络药理学结果的科学性及可靠性。

4 结论

综上所述，本研究基于网络药理学初步预测了山楂、决明子、荷叶中槲皮素、山奈酚、异鼠李素、荷叶碱、杏黄罂粟碱等关键活性成分，通过AGE-RAGE信号通路、MAPK、FoxO等关键信号通路，分别与AKT1、TP53、IL6、TNF及ESR1等核心靶点以氢键方式结合，协同调节脂肪细胞的增值、分化、凋亡，抑制肥胖相关炎症细胞因子分泌，促进巨噬细胞对脂质的摄取，减少肝脏脂肪浸润从而发挥治疗单纯性肥胖的作用，体现了“多成分、多靶点、多信号通路”的作用机制，符合中医“整体观”的理论。但本研究存在一定的局限性，目前的结论只是基于网络药理学对荷叶、决明子、山楂治疗单纯性肥胖的探讨，并未通过实验进一步验证，而公共数据库是实时更新的，信息尚未全面，当下的结论存在一定的滞后及偏差，因此对荷叶、决明子、山楂治疗单纯性肥胖的实验验证将成为下一步研究的重要内容。

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Discussion on the Mechanism of Three Medicinal and Edible Traditional Chinese Herbs in Treating Simple Obesity Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

Objective: Based on network pharmacology and molecular docking method, to explore the mechanism of of active ingredient of hawthorn, lotus leaf and cassia seed in the treatment of simple obesity. Methods: The active ingredients of cassia seed and lotus leaf were obtained from TCMSP, and the active ingredients of hawthorn flesh were obtained using TCMID and ETCM combined with relevant literature. Finally, the corresponding targets of the active ingredients were obtained through TCMSP. Simple obesity targets were collected through GeneCards and OMIM databases. At the same time, Venny 2.1.0 was used to obtain "drug-disease" intersection targets. PPI network map was constructed through STRING platform, and key targets were screened by CytoNCA plug-in. GO function and KEGG path enrichment were analyzed using Metascape database. Finally, AutoDock Vina 1.1.2 was used for molecular docking of key targets and components. Results: A total of 38 active ingredients were obtained through screening, 180 "drug-disease" intersection targets were identified, and 9 core targets were identified through PPI network diagram screening; GO analysis obtained 2338 entries, and KEGG analysis obtained 204 signaling pathways; the results of macromolecular docking showed that the key targets had good binding activity with the core active components. Conclusion: Hawthorn, lotus leaf and cassia seed are used to treat simple obesity through multiple components, targets, and pathways.

medicinal and edible herbs; simple obesity; network pharmacology; molecular docking

R285

A

1008-1151(2023)09-0059-06

2022-09-26

浙江省医学会临床科研基金项目（2018ZYC-A15）。

王相安（1991－），女，浙江杭州人，浙江大学医学院附属第一医院初级营养师，硕士，研究方向为中医药防治营养代谢相关性疾病。

王慧铭（1963－），男，浙江杭州人，浙江中医药大学药学院教授，硕士，研究方向为中药药理。