基于网络药理学和分子对接探讨金银花口服液防治新型冠状病毒感染的作用机制

柯昌虎 ， 吴亚晴 ， 丁雪茹 ， 黄慧敏 ， 严慧

1.湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北 十堰 442008；2.湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000

新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19，简称新冠感染）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，简称新冠病毒）引起的一种急性传染病，在全球范围内迅速蔓延，已成为构成严重威胁人类健康的突发公共卫生事件［1］。初期，尚无治疗COVID-19的特效药物，治疗方案主要是对症支持。在临床治疗中发现，中医药在COVID-19的治疗中发挥了重要作用，它们能够加快轻中度患者康复，显著降低感染患者由中度向重度发展比例，有效改善重症和危重症患者的呼吸困难，稳定血氧饱和度，促进疾病好转［2］。中医药全面参与COVID-19的救治过程，使用中药治疗的患者达到90%，有效率为80%，且无不良反应。相关研究证实中药可以抑制病毒复制和转录，阻止SARS-CoV-2与宿主结合，并减轻病毒感染引起的细胞因子风暴和免疫缺陷［3］，从而有效发挥抗COVID-19的作用。

金银花口服液的主要药效成分为金银花。《神农本草经》中指出金银花性寒味甘，具有清热解毒、凉血化瘀之功效。研究发现，金银花具有抗炎、抗病毒、调节非特异性免疫等作用［4］，且是连花清瘟胶囊、双黄连口服液、痰热清注射液、清开灵颗粒等诸多COVID-19治疗药物的重要组分。湖北省卫生健康委员会在2021、2022年均将金银花口服液纳入《湖北省新冠肺炎中医药防治方案》，作为儿童预防、隔离人群防治结合、无症状感染者治疗的推荐用药。临床应用证实，金银花口服液对187例COVID-19普通型患者的肺部病变具有较好地改善作用，并能够缩短住院天数及病毒核酸转阴时长［5］。金银花汤剂中的MIR2911在体内可以有效抑制新冠病毒复制，加速新冠患者转阴［6］。金银花联合常规治疗有利于COVID-19患者肺部CT、临床症状和实验室指标的改善和临床治愈率的提高，降低重症转化率［7］。现代药理研究发现，金银花可以抑制SARS-CoV-2 Mpro活性，从而抑制病毒的侵入和复制［8］；金银花水提取物可以在体内外诱导let-7a抑制肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）复制和发病，并对SARSCoV-2产生抑制作用［9］。尽管金银花口服液在临床上应用广泛，但其防治COVID-19的作用机制尚待明确。本研究采用网络药理学方法探讨金银花口服液防治COVID-19的分子机制，以期为后续金银花口服液的临床应用及深入研究防治COVID-19的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 金银花口服液成分及靶点的筛选

以“金银花”为检索词，在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）收集金银花口服液的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18进行成分筛选［10］。在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找成分的SMILES格式，并将其导入Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，获取可能性（probability）＞0的靶点。

1.2 COVID-19疾病相关靶点的筛选

以“COVID-19”为检索词，分别在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、比较毒理基因组学数据库（comparative toxicogenomics database，CTD，http：//ctdbase.org/）、治疗靶点数据库（therapeutic target database，TTD，https：//db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https：//www.drugbank.com/）中筛选COVID-19相关靶点，其中GeneCards根据相关性评分（relevance score）筛选前500的靶点，CTD根据推理得分（inference score）大小顺序取前500个靶点。

1.3 药物-疾病共有靶点的筛选

在Venny分析平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）上传金银花口服液与COVID-19的靶点，分别命名为药物名称、疾病名称，风格（style）选择“颜色（colors）”，其余条件默认。绘制韦恩图，获取二者的共有靶点。

1.4 药物-成分-疾病-靶点网络构建

使用Cytoscape 3.8.2软件，绘制金银花口服液防治COVID-19的“药物-成分-疾病-靶点”网络图，使用软件的Network Analyzer功能，以节点度值（degree）为指标进行可视化。

1.5 蛋白互作网络的构建

将共有靶点上传至String数据库（https：//www.string-db.org/），选择最低要求互动得分（minimum required interaction score）＞0.4的靶点，下载TSV格式文件并导入Cytoscape 3.8.2软件中进行可视化。

1.6 功能和通路富集分析

在DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体论（gene ontology，GO）功能富集与京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05为阈值进行筛选，探讨金银花口服液防治COVID-19的生物学过程和信号通路。

1.7 分子对接

利用TCMSP数据库中获取成分的mol2格式，从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）中下载对应的蛋白受体的三维结构。在AutoDock软件中对关键蛋白和成分进行对接分析，再应用PyMOL软件对生成的结果进行可视化。

2 结果与分析

2.1 药物主要活性成分及作用靶点

在TCMSP数据库中共获取236个金银花口服液成分，经OB≥30%和DL≥0.18筛选后获得23个活性成分。在Swiss Target Prediction数据库中获取probability＞0的靶点，去除重复靶点同时剔除没有对应靶点的成分，最后得到16种成分，对应314个靶点，具体结果见表1。

表1 金银花口服液的活性成分信息Table 1 Information on active components of Jinyinhua oral liquid

2.2 疾病靶点检索及药物-疾病共有靶点筛选

使用GeneCards、CTD、TTD和DrugBank数据库筛选COVID-19的靶点，依次得到靶点数目为500、500、65、23个，合并去重后共获得968个靶点。在Venny中绘制金银花口服液防治COVID-19的韦恩图，最后得到共有靶点88个（图1）。

图1 金银花口服液防治COVID-19的靶点匹配韦恩图Fig. 1 Venn diagram of Jinyinhua oral liquid in the treatment of COVID-19

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建

将金银花口服液中16个成分与共有靶点信息输入Cytoscape 3.8.2软件中，绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图。从图2可以看出，共有106个节点，395条边，其中黄色六边形代表金银花口服液，绿色菱形代表药物成分，蓝色圆形代表共有靶点，红色四边形代表COVID-19。Degree排名前6位的成分依次是伞房花耳草素（degree=33）、金圣草素（degree=32）、木犀草素（degree=32）、亚油酸乙酯（degree=31）、山奈酚（degree=31）、槲皮素（degree=31），它们可能是金银花口服液防治COVID-19的关键活性成分。

2.4 蛋白相互作用网络构建

在String数据库中录入金银花口服液和COVID-19共有靶点，物种设定为“Homo sapiens”，选取置信度＞0.4的网络数据，游离靶点2个，得到金银花口服液防治COVID-19的靶点蛋白互作数据，并进行可视化分析。由图3可知，共有97个节点，1645条边，紧密度（closeness centrality）平均值为0.5088，介度（betweenness centrality）平均值为0.0119，degree平均值为28.8214，大于平均度值靶点的有45个。Degree排名前10位的靶点为RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine protein kinase，AKT1，degree=61）、类固醇受体辅助活化因子（steroid receptor coactivator，SRC，degree=49）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，degree=45）、缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A，degree=43）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG，degree=39）、基质金属蛋白酶9（human matrix metalloproteinase 9，MMP9，degree=39）、雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ESR1，degree=36）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1，degree=35）、前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2，degree=34）、基质金属蛋白酶2（human matrix metalloproteinase 2，MMP2，degree=33），这些蛋白可能在治疗COVID-19中具有重要的调控作用。

图3 靶点蛋白相互作用网络Fig. 3 Interaction network of targets

2.5 GO功能分析结果

GO分析结果显示，共有399个条目（P＜0.05），其中生物过程（biological process，BP）共275条，主要涉及细胞迁移的正调控、对外源性刺激的反应、胶原蛋白分解代谢过程、平滑肌细胞增殖的正调控等；细胞组分（cell component，CC）共45条，主要涉及质膜、胞液、细胞质、膜筏等；分子功能（molecular function，MF）共79条，主要涉及腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结合、酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等。分别选取3个部分排名前10的条目绘制气泡图（图4）。结果表明金银花口服液通过调控多重生物学过程对COVID-19发挥防治的作用。

2.6 KEGG通路分析结果

KEGG分析结果显示，共获得108条信号通路（P＜0.05），主要涉及HIF-1信号通路（11个靶点）、化学致癌-受体激活（14个靶点）、内分泌抵抗（10个靶点）、粘着斑（13个靶点）、磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphati dylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt）信号通路（16个靶点）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路（8个靶点）、松弛素信号通路（10个靶点）、红细胞白血病病毒致癌基因同源物（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog，ErbB）信号通路（8个靶点）、丙型肝炎（10个靶点）、乙型肝炎（10个靶点）、RAS相关蛋白1（RAS-associated protein 1，RAP1）信号通路（11个靶点）、雌激素信号通路（9个靶点）、催乳素信号通路（7个靶点）、磷脂酶D信号通路（9个靶点）、甲状腺激素信号通路（8个靶点）等。选择前30条绘制气泡图（图5），这些结果表明金银花口服液的作用靶点分布于不同的信号通路中，并经多途径对COVID-19起到防治作用。

图5 金银花口服液防治COVID-19的KEGG富集分析Fig. 5 KEGG pathway enrichment bubble chart of Jinyinhua oral liquid in the treatment of COVID-19

2.7 分子对接结果

从PDB数据库中筛选受体AKT1、SRC、EGFR、HIF1A、PPARG、MMP9、ESR1、MAPK1、PTGS2、MMP2的蛋白三维结构，将其分别与配体伞房花耳草素、金圣草素、木犀草素、亚油酸乙酯、山奈酚、槲皮素在AutoDock中进行分子对接，结合能小于0，则表明受体和配体可以进行自发结合，结合能越小则越稳定，金银花口服液中10个靶点与6个活性成分之间均可以自发产生结合（图6）。

图6 结合能热图Fig. 6 Heat map of binding energy

受体MMP9与配体伞房花耳草素、金圣草素、木犀草素、亚油酸乙酯、山奈酚、槲皮素均可以产生较强的结合，结合能＜-6.0 kcal·mol-1，如图7所示。其中，MMP9与伞房花耳草素可以通过氨基酸残基ALA242、GLU247、TYR248、VAL223产生5个氢键作用，与金圣草素可以通过氨基酸残基ARG249、GLU227、PRO240产生4个氢键作用，与木犀草素可以通过氨基酸残基ARG249、GLU227、PRO240产生5个氢键作用，与亚油酸乙酯可以通过氨基酸残基ALA189、GLU227、HIS226、HIS230、HIS236产生5个氢键作用，与山奈酚可以通过氨基酸残基ALA242、ARG249、GLU227产生4个氢键作用，与槲皮素可以通过氨基酸残基ALA189、GLU227、LEU188、LEU243、TYR245、TYR248产生9个氢键作用。

图7 分子对接图Fig. 7 Diagrams of molecular docking

3 讨论

COVID-19是由新型冠状病毒引发的传染疾病，属于中医疫病范畴，病因为感受疫戾之气［11］。中医药“治未病”思想和辨证论治凸显特色，未病先防、已病防变、病愈促康，深度介入新冠肺炎预防、救治、康复全过程，突出中医药在新冠肺炎疫情常态化防控工作中的优势作用［12］。金银花口服液是临床上常用的抗炎抗病毒中成药，对机体起到清热解毒、疏散风热的作用。临床应用证实，金银花口服液应用于1例轻型或普通型COVID-19患者，不仅可以缓解症状，还可以明显改善肺部影像［13］。在常规治疗基础上加用金银花口服液，可以显著缓解80例COVID-19患者的发热等症状，并加速核酸转阴［14］。本研究基于网络药理学方法对金银花口服液防治COVID-19的机制进行了探讨。

从金银花口服液中筛选出伞房花耳草素、金圣草素、木犀草素、亚油酸乙酯、山奈酚、槲皮素等活性成分。其中，木犀草素、山奈酚、槲皮素属于黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。研究发现，木犀草素可以作为SARSCoV-2潜在的抑制剂［15］，具有明显地抑制奥密克戎毒株核酸复制的作用［16］。山奈酚可以通过抑制氧化应激、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）通路，减轻脓毒症引起的小鼠急性肺损伤［17］；也对SARSCoV-2具有抑制活性，可以减少Vero E6细胞感染引起的细胞病变效应，能够保护细胞免受病毒诱导的细胞死亡［18］。槲皮素是一种对抗传染性非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）的活性剂，可以作用于ACE2、3CLpro、IL-6等，对COVID-19发挥治疗作用［19］。例如，槲皮素通过抑制NLRP3炎症小体成分和pro-IL-1β的产生，干扰NF-κB等信号通路，从而在COVID-19中发挥抗炎作用［20］；对SARS-CoV-2具有中和作用，与血管紧张素转化酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）具有良好的结合亲和力，从而影响病毒S蛋白与ACE2受体的结合［21］；可以通过抑制mTOR和HIF1A对SARS-CoV-2感染和COVID-19相关癌症进展发挥潜在作用［22］。因此，槲皮素被认为是抑制COVID-19的病理生理过程中发挥作用的最重要的中药成分之一，有望作为COVID-19治疗的潜在药物。

经金银花口服液和COVID-19共有靶点交集筛选出AKT1、SRC、EGFR、HIF1A、PPARG、MMP9、ESR1、MAPK1、PTGS2、MMP2等靶点。其中，SARS-CoV-2感染后Akt/mTOR信号激活和HIF1A被抑制，Akt/mTOR/HIF-1信号级联的失调可能是COVID-19治疗干预的潜在目标［23］。EGFR在SARS-CoV-2等许多病毒进入细胞和复制中发挥重要作用，EGFR的参与影响COVID-19患者C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平、D-二聚体水平以及重症患者的肺纤维化的发展［24］。HIF1A可以抑制ACE2受体和跨膜蛋白酶丝氨酸2（transmembrane serine protease 2，TMPRSS2），并上调去整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17），HIF1A的蛋白靶点与促炎细胞因子表达的激活和随后的炎症过程有关［25］。PPARG（PPARγ）在脂肪组织和巨噬细胞中高度表达，PPARG激动剂通过靶向COVID-19患者的细胞因子风暴可以作为炎症和免疫调节药物调节剂，通过增加ACE2的表达在COVID-19的治疗中发挥有益作用［26］。MMP-9和MMP-2水平与COVID-19之间存在显著的关联。在COVID-19重症患者中，MMP-2下调而MMP-9上调，MMP-2与COVID-19疾病的死亡率独立相关，可能是COVID-19的潜在预后预测因子［27］。雌激素可以与ESR 1/2受体相互作用，通过抑制SARS-CoV-2感染引起的炎症和免疫反应来降低COVID-19患者的死亡率［28］。MAPK调节许多细胞过程，对免疫细胞功能至关重要。例如，miR-194-5p通过磷酸酶张力蛋白样同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）/AKT途径靶向MAPK1的表达，抑制心肌细胞凋亡和损伤［29］。

经GO功能分析获取细胞迁移的正调控、对外源性刺激的反应、胶原蛋白分解代谢过程、质膜、胞液、细胞质、ATP结合、酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性等399条生物学过程。经KEGG通路分析获取HIF-1、化学致癌-受体激活、内分泌抵抗、粘着班、PI3K-Akt、VEGF、松弛素、ErbB、丙型肝炎、乙型肝炎、Rap1等108条信号通路。其中，HIF-1调节可以控制连接缺氧和新冠肺炎的不同信号通路，HIF1A通过减少ACE2的表达来抑制SARS-CoV-2对肺上皮细胞的感染［30］；在SARSCoV-2感染期间，开放阅读框（open reading frames，ORF）3a诱导HIF1A，进而加剧病毒感染和炎症反应［31］。PI3K/AKT/mTOR信号在细菌感染诱导的败血症以及冠状病毒感染中的宿主反应中至关重要，SARS-CoV-2 S蛋白在感染早期通过激活PI3K/AKT途径抑制肺泡上皮Ⅱ型细胞的炎症反应［32］。SARS-CoV-2刺突假病毒（SCV-2-S）通过上调细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平来抑制PI3K/AKT/mTOR途径，促进自噬反应，并引发感染细胞的炎症反应和凋亡［33］。VEGFR-2在SARS-CoV-2感染中表达上调，VEGF/VEGFR-2相互作用与SARS-CoV-2相关的肺水肿有关，以VEGF/VEGFR-2信号通路为靶点可能是治疗新冠感染的潜在治疗策略［34］。SARS-CoV-2可以刺激肠中产生过量的VEGF，细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/VEGF可以作为肠道炎症和COVID-19疾病进展的潜在生物标志物和治疗靶点［35］。内皮的血管通透性过高，导致COVID-19等各种疾病的发生和发展，Rap1可以调节血管内皮通透性，可能是预防血管通透性过高相关疾病中血管屏障功能障碍的理想药物靶点［36］。最后，通过分子对接发现药物成分与靶点之间具有较强的结合作用，表明金银花口服液具有防治COVID-19的功效。

综上所述，本研究以网络药理学联合分子对接方法对金银花口服液防治COVID-19的物质基础和分子机制进行探索，发现金银花口服液中的伞房花耳草素、金圣草素、木犀草素、山奈酚、槲皮素等成分可以作用于AKT1、SRC、EGFR、HIF1A、PPARG、MMP9、ESR1、MAPK1、PTGS2、MMP2等靶点通过多途径防治COVID-19，从而为金银花口服液的临床应用和机制研究提供了依据。然而由于数据库的局限性，本研究基于分子水平的预测以及黄酮类成分对COVID-19的影响仍需进一步的细胞或动物实验进行验证。